硫色曲霉木聚糖酶基因xynB在毕赤酵母中的分泌表达的研究.pdfVIP

硫色曲霉木聚糖酶基因xynB在毕赤 酵母中的分泌表达研究 曹云鹤‘乔家运李一航 (农业部饲料工业中心，中国农业大学，北京100094) 摘要奉试验旨在探讨硫色曲霉木聚糖酶在毕赤酵母中的表达情况。接熙硫色曲霉未聚耱酶基因xyllB序 筛选获得分社表选的重组菌株。将重组茸株接种YPD液体培养基。28℃振荡培养2—3天后取上清波分析， sDs—PAcE检测结果表明，表达蛋白的分子量太小约为”kDa。酶学性质分析表明，该未聚糖酶的最适催化温 度为柏℃．最适pH值为4．4。 关键词硫色曲霉未聚糖酶毕赤酵母分泌表达 木聚糖是由B一1，4一木糖苷键连接丽成的线状木糖多聚体。侧链上连着多种不同的取代基。在 自然界中，木聚糖是第二丰富的半纤维素类多糖“】，在被子植物中木聚糖占干物质重的15％一30％， 在裸子植物中占干物质重7％一12％”1。木聚糖在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其 他养分的吸收利用。具有很强的抗营养作用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦 等)的应用。 工业上降解木聚糖的方法主要有两种，即酸解和酶解。酸解作用较快，但常伴随着有毒物质的生 成，而且容易引起容器的腐蚀”1。降解木聚糖的酶类主要是内切B—l，4一木聚糖酶(Ec 3．2．1_8)。能将木聚糖分解成低聚糖、木糖和少量的阿拉伯糖。自然界中，除细菌、真菌等微生物 产生木聚糖酶外，藻类、原生动物、甲壳类动物、昆虫、蜗牛和植物的种子等都可产生木聚糖酶”j。 目前，用于生产实践中的木聚糖酶主要来自于真菌，因为真菌产生的木聚糖酶能够分泌到培养基中， 易于纯化，而且活性较高”J。在产木聚糖酶的真菌中研究较多的是曲霉(Aspergillus8p．)，到目前为 止，已有十几种曲霉产木聚糖酶的性质获得了深人的研究”“…。本实验室克隆了一种硫色曲霉的木 聚糖酶基因xyIlB，并在大肠杆菌中进行了诱导表达。由于在大肠杆菌中表达的酶蛋白形成包涵体， 没有活性且纯化困难，不利于大规模工业化生产，因此，本文对利用毕赤酵母分泌表达该酶进行了 研究。 l材料和方法 1．1材料 1-1．1菌种：大肠杆菌ToplO和毕赤酵母x一33均由本实验室保存。 1_1．2载体：pGAPzⅨA购自Invitrogen公司。 1．1_3主要试剂：LA1铀DNA聚合酶、Ecom、】【baI、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司； ·基金项目：国家科技部动物营养与饲料加工创新群体科学基金项目。 作者筒舟：曹云鹤(197l一)，男，博士，副研究员．主要从事蛋白质工程研究，E一叫n：咖曲@m日li。扯cn ·436- 分子营养与新接术研究 工生物工程公司完成，DNA序列分析由北京三博远志生物技术有限公司完成。 1．2方法 1．2．1硫色曲霉木聚糖酶基因xynB的扩增 灭菌水40山，模板1山，LATaqDNA聚合酶l山，lox缓冲液5 1一，引物各1山(O．1峭／山)。PcR 电泳检测。 1．2．2表达载体的构建与转化 性化的载体电击转化毕赤酵母x一33感受态细胞(2000v，5 30℃生长2—3天。挑取单菌落在YPD平板上划线培养，4。c保存备用。 1．2．3酶学性质分析 2Inin，取上清液进行12％的sDs—PAGE分析，并测酶活。 pH值为4．4的条件下，每分钟从浓度为5n·∥Ⅱd的木聚糖溶液中降解释放l岬01还原糖所需要的酶 量为一个酶活力单位。每一样品测定均设三个平行试验，相对误差控制在5％以内。酶活性测定缓冲 液为Na2HP04一柠檬酸缓冲液。 2结果与讨论 2．1载体构建及表达 木聚糖酶是木聚糖水解酶系中重要的酶之一，不同来源的木聚糖酶的分子量变化较大，在8— 145kDa之间91。关于木聚糖酶的分类并没有统一的标准，wong等””认为可以根据催化反应的终产 同源性，表明这两个家族在进化上来源于不同的祖先。同一族的木聚糖酶在催化结构域具有同源性。 酵母组成型表达载体的多克隆位点，经过筛选获得了重组克隆(图2)。 于28℃振荡培养2—3d，取上清液测酶活，筛选到一株重组菌株，分泌表达木聚糖酶。sDs—P