花椰菜胞质不育及育性保持相关基因的克隆与分析的研究.pdfVIP

摘要 摘要 花椰菜属十字花科，芸薹属，是一种重要的蔬菜类作物。利用花椰菜细胞 质雄性不育系及相应的保持系、优良父本所进行的杂交优势利用，已广泛用于 花椰菜高品质杂交种的生产。但在实际育种中，可利用的花椰菜细胞质雄性不 育资源十分有限，而选育或创建新型花椰菜细胞质雄性不育系的理论基础尚不 健全，这在很大程度上阻碍了花椰菜杂交优势的利用。为此，开展花椰菜细胞 质雄性不育相关分子机制的研究，不但可为利用花椰菜细胞质雄性不育系进行 杂交制种提供理论支持，而且也可在深层次上认识花椰菜细胞内核质互作的机 理。 本论文以花椰菜细胞质雄性不育系和相应的保持系为材料开展了如下方面 的研究： 1．基于同源序列的候选基因克隆法，选定7个最有可能与花椰菜细胞质雄性不 育相关的基因，分别为Ⅱp口、np6、口p9、cox，、c“Ⅳ、。，归和。伊刀，最 终确定D厂馏与其雄性不育密切相关。对D，徊的转录分析表明，D哆曰只在细 胞质雄性不育花椰菜中转录。序列分析表明，D们，与Ogura型胞质不育萝h 的雄性不育相关基因D，一38高度同源。进一步分析，利用报道的o，∥38位点 处的序列设计引物，PCR扩增，在花椰菜细胞质雄性不育系中克隆到包含。庐 全长的一段序列。该序列结构与Ogura型胞质不育萝nD伊38位点处的一致， 含有三个可编码区：们∥M、D胡如和Dc，=『58。转录分析显示其中的D叩38 和D们船与Ogura型胞质不育萝h中的一样可共转录。但对这些转录产物的 RNA编辑分析发现，在细胞质雄性不育花椰菜中。蜩}位点处的RNA编辑， 可能有着特殊的编辑机制，并且发现有个别位点的RNA编辑在细胞质雄性 不育花椰菜和02ura型胞质不育萝h中有所不同。因此，认为尽管实验所用 花椰菜不育系也为Ogura型胞质不育，但二者雄性不育的具体形成机制有所 不同。 2．采用同源序列的候选基因克隆方法，克隆了花椰菜两系内的线粒体基因 ”Ⅱd3细s，2。分析发现该基因位点处的基因结构在两系中存在差异，但基因 在转录水平未表现出不同。进一步对该基因在两系中的RNA编辑情况进行 摘要 了深入研究。采用cDNA．SSCP结合测序技术共检测到12种不同的RNA编 辑模式，20个RNA编辑位点。其中特异出现在细胞质雄性不育系中的RNA 编辑模式有9种，在保持系中的有3种。RNA编辑位点在细胞质雄性不育系 中主要以c到u的不完全编辑为主，而在保持系中完全编辑和提前编辑的位 点占优势。结果表明基因”口出细s，2的RNA编辑在花椰菜两系中存在明显 不同，推测其与花椰菜细胞质雄性不育的发生有关。 3．对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系的基因组进行了RAPD和ISSR分析。 筛选了406条RAPD引物，检测到了2160条清晰可辨的条带，而其中只有 引物S2121在保持系中扩增出一条约900 bp的特异带。根据测序结果设计特 异引物将其转化成特异PcR标记，命名为s212l 900。随后又筛选了30条IssR 引物，在两系中共扩增出306条清晰可辨的条带，只有引物ISSR3在两系的 扩增中表现出多态性，在保持系可检测到一条约1100bp的特异条带，命名 了Souchem斑点杂交分析，单株及已知育性花椰菜材料检测等实验。结果进 一步证实S2121 900和ISSR31100确为花椰菜保持所特有。序列分析表明， s2121 900与甘蓝型油莱及拟南芥线粒体基因相应区段高度一致，并且序列中 存在多个潜在的RNA编辑位点。推测S2121900极有可能来源于花椰菜线粒 体基因组，且具有编码功能。初步的转录分析也证实s2121900在保持系中表 现为特异性转录，可检测到一条约350bp的特异转录物。ISSR3lloo也与报道 的一些线粒体基因序列具较高同源性，推测其也源于花椰菜保持系线粒体基 因组，但还有待于进一步验证。 4．采用DDRT-PcR技术对花椰菜细胞质雄性不育系和保持系内基因的差异表 达