A9.树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究.pdfVIP

A9．树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究 北京大学第一医院(100034) 张恒辉何豫赵鸿朴文花刘茂昌席宏丽于敏王贵强 目前认为，HBV慢性感染的主要原因是针对HBV特异性细胞免疫功能的低下。Dc是功能最强大的 抗原递呈细胞，在病毒抗原摄取、递呈及特异性免疫激活中均具有重要作用，是抗感染免疫的中心环 节，而近年来研究发现慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitisB，CHB)的树突状细胞存在成熟及功能的异 常，导致其激活特异性抗病毒免疫反应特别是细胞免疫反应的能力低下。因此，恢复CHB患者Dc的功 能，增强其激活特异性抗HBV病毒免疫的能力，则可能起到打破免疫耐受，彻底清除病毒的作用，有 助于CHB治疗。 本研究通过在体外进行CHB患者单核细胞树突状细胞方向转化，并辅以聚肌胞poly(I：C)刺激， 增强DC的成熟和功能，活化病人自身的T淋巴细胞，以获得数量更多、功能更强的HBV特异性的 胞的数量和功能。 1．材料和方法 者，诊断符合按2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议制定的《病毒性肝炎防治方案》(2000年 HBe奴、HBeAb、HBcAb，并用荧光定量PCR方法检测HBV 染。近半年没有接受过抗病毒治疗。所有研究对象均无心脑肾及其他器官合并症。 1．2主要试剂与仪器：重组人粒一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—CSF)和重组人白细胞介素4 购于Amersham Elispot试剂盒购于美国叻公司。HBV colel8．27 Dickinson tetramer)本研究室构建。流式细胞仪(now FACScan)。CTLIMMUNOSPOT分 cytome廿v，Becton Ltd．)。 析仪([mmtmospotAnalyzer，CellularTechnology 1．3 PBS洗3 遍。最后用1％多聚甲醛300t,l重悬固定，行流式细胞仪检测。同时每份标本均设自身阴性对照。 Hypaque分离PBMC以完全的RPMI 0．5ml，37。c 1640液轻轻洗培养 5％c02孵箱培养2h，使其中的单核细胞贴壁，用温热的无血清的RPMI GM— 板以去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞，参照RomaniN的方法，在培养板中加人含rh CSFIOOOIU／ml、rh—IL一4 hC的作为对照，共 液。培养第7天，每孔加入0～500mg／miPotyI：C，间隔浓度为75te／ml，以不加Poly 培养9—10天，收集悬浮细胞。收集的细胞通过光镜的观察形态学、电镜观察超微结构+以及通过流式 鉴定。 corr．． 一74— 18—27 x 入经尼龙毛柱分离的自体T细胞，细胞数1105／孔，24h后加入IL一230U／ml，隔天半量更换培养基， 继续培养48—72h，收获细胞并计数，测定其功能。以T细胞单纯IL一2维持组作为阴性对照。 1．6 Elispot检测T细胞分泌IFN—y的1、细胞频数：采用BD公司IFN一7 Elispot检测试剂盒。将96 20 lOOt』1／j1．，0．1％Tween 用