天津绿脓假单胞菌B内酰胺类抗生素耐药相关基因的研究.pdfVIP

．．112．． 灭津绿脓假单胞菌B内酰胺类抗生素耐药相关基因研究 付建荣刘群张艳红刘金伟刘静李建 绿脓假单胞菌(Pseudomonasaerugfnosa，Pa)是临 床常见的条件致病菌之一。近年来Pa菌耐药性逐年上升， 耐亚胺培南的菌株已不再是罕见事例。研究发现，Pa菌产 循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2％琼脂 生各种B内酰胺酶(kuTEM、SHV、0XA、PER、VEB、GES、CARB)、糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。 耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA 膜孔蛋白D2(oprD2)缺失是对B内酰胺类抗生素耐药的主 要机制[1-7]。为了鳃金属B内酰胺酶(如IMP、VIM)和质粒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。 AmpC酶(如DHA、FOX、MOX)以及我院临床分离耐亚胺培南 的Pa菌对B内酰胺类抗生素耐药原因，我们采用分子生物 表1靶基因PCR引物序列 学技术检测了13种IB内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM、 SHV，OXA—10群、PER，VEB，GES，CARB，IMP，VIM，DttA、 MOX、FOX和oprD2)，报告如下。 材料和方法 1．菌株来源：36株Pa菌均分离自天津第四医院2004 年4月至2006年1月烧伤住院病人临床标本。均为烧伤创 面分泌物。用生物梅里埃公司VITEK．AMS系统鉴定菌种。 标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和绿脓假单胞菌 ATCC27853。 2．药敏试验：采用K-B法测定14种抗菌药物的敏感 性。并根据美国临床实验室标准化委员会(National Committee forC1inical Standards，NCCLS) Laboratory 2004年版要求进行抗生素敏感性判断。 3．细菌处理：挑纯培养菌落置入0．5ml离心管内(内 已预置200ng／ml蛋白酶K溶液)。56℃水浴2h，改95℃水 浴lOmin。离心15000转／min30s，移液器吸取上清液移 人另一新的0．5ml离心管作为模板液置人-20C冰箱备用。 4．基因检测：均为PCR法，各种靶基因引物序列和目 的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应 u 体系P1、P2引物各0．5mol／L，KCI10mmol／L，(NIl4)2S04 8mmol／L，MgCl22retool／g，Tris-HCl(pH9．0)10mm01／L， NP400．5％，BSA DNA IU。总反 0．02％(wt／v01)，Taqpol 应体积20ul(其中模板液5u1)。热循环参数(PCR产物长 度500bp)为：934C预变性2min，然后93C60s、55C60s、 工作单位：300222天津第四医院检验科(付建荣、张艳红、刘金伟、 刘静、李建)，烧伤科(刘群) 通讯作者：付建荣，电话：022电子信箱：fujianrongllO鞠 结 果 t63，cQ咀 1．抗生素敏感性试验结果：见表2。 ．．113．． 表236株Pa菌对14种抗菌药物的敏感率I株(％)l P： 阳性对照，N： 阴性对照，s：标本阳性 图2 GES基因PCR电泳图 2．基因PCR检测结果：36株Pa菌中GES阳性36株 (100％)、TEM阳性20株《55．6％)，oprD2基因均缺失 21株(58．3％)，其余基因均为阴性。1号株GES基因PCR 产物直接测序，测得可读序列811bp，经BLASTn软件比 P： 阳性对照，N： 阴性对照，s1，S2：