双重荧光定量PCR检测猴小肠结肠炎耶尔森氏菌与空肠弯曲杆菌研究.pdfVIP

双重荧光定量PCR检测猴小肠结肠炎耶尔森氏菌和空肠弯曲杆菌研究 温和心“2，蒋荣华。，二l!杰1，李世照。，龙英全1，罗博1，盘宝进2 00；2．国家灵长类实验动物检测重点实验室广西南宁 (1．贵港出入境检验检疫局广西责港5371 530021) 小肠结肠炎耶尔森菌(YE茵)和空肠弯曲杆菌(空弯菌)是一种在世界范嗣内广泛流行 的人畜共患病的病原茵，主要引起人类的急性肠炎。YE菌能在冷藏温度一F(卜4℃)生长繁殖， 俗称“冰箱菌”。韩国和加拿人对我国出口的实验猴提出了YE菌检疫要求。空弯菌已经取代 沙门氏菌成为发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，将来某些国家很可能提出该菌的检疫要 求。 猴YE菌GB标准检验耗时过K，仅增菌步骤需要3周时间。空弯菌是微需氧菌，培养条件苛 刻，难以培养成功。以上两种细菌的检验方法存在着较大的技术上的缺陷和操作上的困难， 难以适应实验动物检疫准确快捷的要求。上世纪90年代末在PCR基础上发展起了荧光定量 PCR，该技术融汇了PeR技术的高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性汞I高精 确定量的优点，直接探测PcR过程中荧光信号的变化，从而进行定量，由于整个反应一检测在 封闭管中进行，解决r传统PCR污染问题，检测过程简便快捷，耗时一般不超过2d,时。多重 荧光PCRHP把多个检测整合到一个反应中，结果互不干扰的最新的荧光PCR技术，该技术可以 成倍地提高：l：作效率，成倍地减少检测成本，是YE菌和空弯菌检验较理想的方法。 1材料与方法 1．1菌株 链球菌1株(32210)，金黄色葡萄球菌l株(26003) 1．2主要试剂 荧光PCR预混液：购白人连Takara公司；计数培养基、鲜血琼脂、营养肉汤、布氏肉汤 等培养基：购白北京陆桥公司；DNA提取液购白广州达安基冈公司；生化培养箱，密封罐， 微需氧产气袋：购白J。尔环凯生物公司。 1．3模板DNA的提取 煮沸裂解法：取lOOul菌液离心，沉淀川生理盐水洗涤2次，最后川lOOul超纯水悬浮，隔 水煮沸15min，12000rpm离,心5min，取上清液，即为DNA模板溶液。 1．4引物和探针的设计与合成标记 根据科研文献报道的两种细菌的引物和探针序列，通过GenBank中的Blast检测引物和探 Premiat2．0软件进行分析，完 针的配对情况，对其中的几个碱基做了修改，应月jPrimer 全符合Taqman弓I物和探针设计要求厉雨由人迮Takara公司合成。本研究选用的报告基团FAM 雨lCy5的发射波K相差比较远，避免了因荧光波长相近而互相干扰，确保了试验的灵敏度和 特异性。引物探针详细信息如下： YE菌引物探针：YST—F(上游引物)：AATGCTGTClvrCATTTGGAGC： YS卜R(下游引物)：Al’CCC从TCACTACTGACTTC； YST—P(探针)：5’一FAM—CAAGCAAGCTTGTGATCc，rCCG—TAMRA一3’： 空弯菌引物探针：VSI—F(上游引物)：A1vrCGCGTGGCA从CATC； vSI—R(下游引物)：GCGACCTTTCTCTGAAATATT从TTGT； VSI—P(探针)：5’一Cy5-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA—BHQ3—3’。 1．5双重荧光PCR方法的建立 1．5．1反应条什和参数优化根据人连Takara推荐的反应条件建立荧光PCR方法，经对反应 条件和反应参数进行优化，建立双重荧光PCR方法。最后确定双重荧光PCR的最佳反应条fl：： 0．4ul，模板2ul， TaqMan预混液lOuI，lOumol／L上、下游引物、荧光标记探针各0．8ul，ROX S，60℃34S(检测荧 加超纯水至总体积20ul。最佳反应参数为：95。C预变性30S：95℃5 140 光信号)，40个循环。采川ABI7500荧光定鼙PCR仪配备的分析软什进行数据分析与处理。YE 菌和空弯菌的Ct值(循环阂值)35为试验刚性：Ct值≥35，且扩增曲线明显呈对数增长判为 可