彗星试验方法.docVIP

主要仪器 数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器。　 主要试剂 氯化镉（CdCl2·2.5H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批使用时用去离子水配制成不同浓度。 正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，溴化乙锭（EB）。 氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚砜（DMSO），盐酸（HCl）等，均为国产分析纯试剂。 主要溶液的配制 磷酸缓冲液（PBS） NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，无Ca2+、Mg2+双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4℃保存备用。 0.5%正常熔点琼脂糖（NMA） 0.5g NMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。 0.5%低熔点琼脂糖（LMA） 0.5g LMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4 ℃保存备用。 细胞裂解液 精确称取NaCl 146.1g，Na2EDTA 37.2 g ，N-十二烷基肌氨酸钠10 g，Tris 1.22 g，放入1000 ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁力搅拌溶解（可加热），以4 mol/L NaOH调pH到10.0，在容量瓶中加水定容到1000 ml。冰箱4℃保存备用。临用前根据用量按总体积加1% Triton-X-100，10% DMSO混匀。 碱性电泳缓冲液 Na2EDTA 0.186g，NaOH 6g，加500ml双蒸水定容，pH13，现配现用。 Tris-HCl中和液 称取Tris 48.44g，加600ml双蒸水溶解，用浓盐酸（约13.5ml）调pH值至7.5，加水定容到1000ml，4℃保存备用。 EB染色液（0.03mg/ml） 溴化乙锭（EB）3.0mg，双蒸水100ml，避光4℃保存备用。 试验分组 染毒单细胞凝胶电泳试验 在染毒第40 d时，各组小鼠摘眼球取血后打开胸腔，左心室插管，右心耳打一切口，生理盐水快速灌流至动物尸体展开，肢体变硬为止。迅速取肺脏组织，用冰冷的PBS漂洗三次至无血，再用不锈钢剪刀将其剪碎，加适量PBS液到玻璃匀浆器研磨，并过300目不锈钢筛网，得单细胞悬液。然后以5000r/min离心5min，轻轻吸去上层溶液，再加PBS，冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为106～107个/ml，台盼兰染色镜检细胞存活率（细胞存活率90%以上），立即进行以下步骤。 （1）胶板的制备 ① 第一层胶的制备：将已预热56℃的80μl 0.5%正常熔点琼脂糖NMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）滴到同样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。 ② 第二层胶的制备：取10μl含1000个细胞的PBS和75μl 0.5%低熔点琼脂糖LMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37℃混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置10min使其凝固。 ③ 第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85μl预热37 ℃ 的0.5% LMA，盖上盖玻片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。 （2）细胞裂解 移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。 （3）DNA碱解旋 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA，使DNA断链，在电泳场中易于迁移。（4）单细胞电泳 在25v、300mA条件下电泳20min。（5）中和与染色 电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HC（pH7.5）中和15min。然后每片载玻片上滴加50μl 30μg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。 （6）试验结果观察与数据处理 EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。① 每只小鼠的肺组织制片子，各组小鼠肺，利用统计软件SPSS 10.0进行X2 检验。②/index.php) 对彗星图像进行指标分析，用 ±S表示，并利用统计软件SPS