动物细胞工程第四章胚胎工程.pptVIP

①室温下，将胚胎移入含10%甘油的PBSS中平衡10min； ②将胚胎转移到含10%甘油＋20%乙二醇的PBSS中； ③最后将胚胎移入含25%甘油＋25%乙二醇的PBSS中，立即装管； ④将细管在液氮罐颈部（温度为－23℃――25℃）预冷5min后投入液氮保存； ⑤解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡7S，迅速投入20℃温水中，摇动细管使其解冻均匀； ⑥收集胚胎，将捡出的胚胎移入含1.0mol/L蔗糖的PBSS是平衡10min，进一步脱除保护剂，再用PBSS洗涤胚胎2－3次后用于移植。 特点: 方法简单、快速，减小冰晶对胚胎造成的损伤； 缺点: 玻璃化溶液的浓度极高、溶质存在毒性，使胚胎的成活率降低。 四 冷冻 效果 鉴定 1、形态学鉴定 解冻后在显微镜下观察，能恢复到冻前形态，透明度适中、胚内细胞致密、细胞间界限清晰。 2 染色 检查 ①荧光染色　生活力愈强的胚胎显示出愈强的淡绿色荧光，死亡或生活力降低的胚胎不发荧光或仅有微弱荧光。 ②台盼蓝染色 3、培养鉴定 ①体外培养　胚胎解冻后，用含血清的PBS在37℃下培养6－12h，能继续发育者为存活胚胎。 ②异体培养　将胚胎解冻后，置于结扎的兔输卵管内，在兔体内培养12－24h。再从输卵管内冲洗出来，检查发育情况，存活的胚胎能进一步发育。 4 移植 检验 将解冻后的胚胎