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普通生物学实验十：淀粉酶纯化与活性测定 来源：普通生物学教学网 作者：王飞 发布时间：2010-03-14 查看次数：749 一、实验目的 1．了解淀粉酶对不同底物的专一性； 2．了解温度对酶的影响； 2．掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法。 二、基本知识与原理 1．酶的概念 自然界中的一切生命现象都与酶的活动有关系。活细胞内全部的生物化学反应都是在酶的催化作用下进行的。如果离开了酶，新陈代谢就不能进行，生命就会停止。酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。绝大多数酶是蛋白质，少数的酶是RNA。 2. 酶的性质 酶是生物催化剂，除了具有化学催化剂的特性（例如只需微量就可以使所催化的反应加速进行，而其本身的质和量都不发生变化）以外，还具有一些不同于化学催化剂的特性。（1）酶的催化能力远远超过化学催化剂；（2）酶具有高度的专一性：（3）同一般的催化剂相比，酶很容易失活。 3．影响酶活力因素 酶的催化作用，受到温度、pH和某些化合物等因素的影响。（1）温度的影响 在一定的温度范围（0~40℃）内，酶催化作用速度随着温度的升高而加快。但超过60℃，绝大多数的酶就会失去活性。（2）pH的影响 酶对环境中的pH十分敏感，只有在一定的pH范围内才能表现出活性，超过这个范围，酶就失活了。一般酶的最适pH在4~8之间。（3）激活剂和抑制剂的影响 有些物质（大都是离子或简单的有机化合物），能够增强酶的活性；有些物质能够抑制酶的活性。 5．淀粉酶 淀粉酶能作用于淀粉中的α-1,4葡萄糖苷键，使淀粉分解为麦芽糖。反应方程式如下：2（C6H10O5）n + n H2O n C12H22O11 但是不能作用于蔗糖分子的α-D吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃 果糖的C2之间的糖苷键。淀粉的还原性极小，而唾液淀粉酶（主要含α-淀粉酶）水解淀粉后形成的麦芽糖有还 原性，能使3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解，从而了解酶作用的专一性。 6. 酶活力 也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的唾液淀粉酶液，于37℃、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。在一定范围内，反应液的棕色深浅与还原糖的含量成正比，在波长540nm处测定溶液的吸光度，根据标准液浓度得吸光度，便可求得样品中还原糖得含量。 三、实验器材 1．实验材料：淀粉酶液 2．实验试剂：可溶性淀粉、二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.8）、1mg/ml 标准麦芽糖溶液 3．实验设备：洗瓶、试管架、玻棒、水浴锅、分光光度计 四、实验步骤 1．唾液淀粉酶的制备 （1）提取：先用水漱口清洁口腔，然后含1小口（约5 ml）蒸馏水于口中轻漱1~2 min。 （2）过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。 （3）稀释：取滤液1 ml，用水定容至50 ml。作为淀粉酶的样品。 ◆ 由于不同人或者同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50~300倍，甚至超过此范围。 2．唾液淀粉酶的专一性实验 取4支试管，按表5.1编号并记录所观察到的颜色。 表5.1 唾液淀粉酶的专一性实验和酶活测定 管号 操作 1 2 3 4 5 5 pH6.8 缓冲液（ml） 1 2 1 1 2 1 蔗糖溶液（ml） 1 1 0 0 0 0 淀粉溶液（ml） 0 0 1 1 1 1 淀粉酶液（ml） 1 0 1 0 0 0 煮沸过的唾液（ml） 0 0 0 1 0 0 标准麦芽糖溶液（ml） 0 0 0 0 0 1 酶促反应 摇匀，37℃水浴3min DNS试剂（ml） 各2 显色反应 沸水浴5min 颜色 A500nm光吸收值 3．唾液淀粉酶活力的测定 用5号空白管座对照：在500nm处测定3、5管的吸收值。将数据填入表5.1。 4. 计算 根据溶液浓度与光吸光值成正比的关系，即： A标准＝c标准 则c（酶液管中麦芽糖浓度）＝A酶×c酶 A酶 c酶 A标准 （其中c为浓度，A为吸光值） 本实验规定：在37℃、pH6.8的条件下，每3min水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活单位。 总活力单位＝c酶×n酶 （c酶为麦芽糖的浓度；n酶为稀释倍数） 附：分光光度计的使用： （1）先了解仪器的各个操作旋钮的功能和电表的读数方法。