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血管形成的测定方法_药学论文 血管形成的测定方法_药学论文 作者：王会萍，李卫东，王丽京 【关键词】 血管形成 测定方法 血管形成是从已经存在的血管床中通过内皮细胞增殖和迁移,以芽生或非芽生的方式生成新生血管系统的过程，与正常的生理过程(如伤口愈合、胚胎发育等)和许多病理过程(如肿瘤的生长和转移、类风湿性关节炎、脑和心血管等疾病)密切相关[1, 2]。血管形成中的主要细胞是内皮细胞，它存在于所有的血管上，通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建构成了新的毛细血管网。除内皮细胞在血管发生过程起重要作用外，支持细胞(如肿瘤细胞、外周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞)、细胞外基质、血液细胞和体液成分也都与血管的发生有关。因此，血管发生的测定非常复杂。当今尚未有任何一种体外的实验方法能精确地模拟这一复杂的过程，但结合体外、体内血管形成的测定方法，可以有效地了解血管发生的作用机理。本文介绍了当前体内外用来研究血管形成的一些基本方法和最新方法，并对这些方法的优缺点进行了深入探讨。 　　1 血管形成的体外测定方法 　　体外测定血管形成的方法主要侧重于外源性抑制剂或刺激因子对内皮细胞的迁移、增殖和成管的作用。 　　对内皮细胞的测定，关键问题在于内皮细胞具有物种和器官的差异性。内皮细胞表型的差异已在大血管衍生的内皮细胞(如人脐静脉内皮细胞)和微血管器官的内皮细胞(如人类皮肤毛细血管内皮细胞)中被证实[3, 4]。在培养中，内皮细胞的活化状态、染色体表型、细胞表面抗原的表达和它们的生长特性都会发生改变，将失去体内生长的一些特性[3]。另外，在体外，内皮细胞在静止环境、动态环境、结合不同的基质的情况下，它们的特征也不同，因此它并不能完全代表体内复杂的生理过程。尽管用内皮细胞作为模型来研究体内血管发生具有很大的局限性，但体外测定方法具有快速、易定量、可重复性高等特点。 　　1.1 内皮细胞增殖测定法 　　血管内皮细胞的增殖是血管发生的重要步骤。目前，已有多种成熟的细胞增殖测定方法，如四氮唑盐还原法等。[3H ]胸腺嘧啶掺入法和细胞周期动力学检测法是两种主要的细胞增殖测定方法。 　　四氮唑盐〔3〕还原法，又称MTT比色法，是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT结晶形成量与细胞数成正比。该方法已被用于检测活细胞增殖，并广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等[5]。 　　与之相比，[3H ]胸腺嘧啶掺入法是一种更好的测定细胞增殖的方法。将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H作为DNA合成的前体掺入到增殖细胞中,通过放射自显影观察细胞增殖情况。传统的以5溴脱氧尿苷(BrdU)作为核苷酸取代胸腺嘧啶掺入到新生成细胞的DNA中，通过用单克隆抗体检测与DNA结合的BrdU ，反映细胞增殖状态的方法，虽然较以上方法有所进步，但其仍或多或少的受外源性示踪物的影响[6]。同时细胞增殖的变化可能是由细胞毒性而非测试药物的影响作用，因此结合细胞增殖测定法和细胞凋亡检测法的特点，可能会获得更为精确的结果。 　　1.2 内皮细胞迁移测定法 　　目前，对血管内皮细胞迁移的影响，已经有很多有效的测定方法。其中以改良的Boyden Chamber 或Transwell 法最常用[7] 。这些方法均是通过观测穿过一定孔径(如8 μm) 硝酸纤维素薄膜的细胞数量,确定细胞迁移能力。近年来虽然又有新型Millicell底膜培养皿式双室联合培养系统出现,但是它们的原理一样,利用细胞穿过微孔滤膜来观测一种细胞对另一种细胞迁移的影响。 　　划痕损伤的方法在国外出现较早。用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培养皿上划痕，为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域。经过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并重新形成新的单层内皮细胞层。在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离，并计算出细胞的实际迁移距离。然而这种方法的定量具有任意性。 　　1.3 成管测定法 　　血管形成中最典型的测定是对内皮细胞形成三维结构能力的测定。在体外给予适合的细胞外基质成分，内皮细胞能形成管状结构。在含有胶原和纤维蛋白凝块的塑料培养皿中，内皮细胞初期在水平面形成细胞条索结构，经过12 h或更长时间培养，细胞条索开始向上发出分支，贯穿凝胶形成三维的管状网络结构[8]。在一系列的血管发生测定中，成管测定占有重要的位置[9, 10]。内皮细胞不仅能在二维空间形成毛细管，也能在三维空间对细胞行为进行定量分析，这更为接近体内细胞生长的环境。定量分析包括在凝胶中从下到上对不同长度管进行拍照，测量每个管的长度(水平面上的宽度和垂直面的高度)和管的最大直径等。