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植物抗冻基因研究进展 李 璐 王晓军 赵民安 中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011 植物在低温下一般会遭到不同程度的伤害。温度又是决定植物地域分布的主要限制因素，每年由于低温寒害引起的作物损失巨大，而传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用不大。近20年来，采用分子遗传学研究手段，大量冷诱导表达的基因已分离出来，并证明这些基因对提高植物的抗寒性有一定的作用。本文对这一领域的研究作一介绍。 1 已分离和鉴定的冷诱导基因 Weiser〔1〕最先提出植物在低温锻炼过程中基因表达会发生改变的观点，并指出植物的低温适应性可能需要两个条件，即特异基因的转录激活和在最大抗寒过程中新蛋白质的低温诱导合成。Guy等〔2〕最先证实菠菜在低温锻炼中基因表达确实发生了改变。迄今人们已经分离出大量冷诱导表达基因。在这些基因表达的产物中，一些已证实是有已知酶活性的蛋白，它们可能对提高抗寒性有一定程度的作用〔3〕。如拟南芥的fad8基因〔4〕和大麦的blt4基因〔3〕，它们分别编码脂肪酸去饱和酶和一种脂肪迁移蛋白。通过这种脂肪酸去饱和酶或脂肪迁移蛋白改变质膜的组成以提高膜的冷稳定性。还有各种编码信号转导和调控蛋白的基因，包括激活细胞间接分裂的蛋白激酶，Ca2+依赖性蛋白激酶和14-3-3蛋白（即色氨酸酪氨酸羟化酶依赖性激活蛋白）等，在低温胁迫中也同样发挥作用〔3〕。它们可能是通过控制冷诱导基因的表达或调节抗冻蛋白的活性而影响植物的抗寒能力。 从氨基酸的相似性来说，虽然这些低温诱导合成的多肽划分为不同的类别，但它们在不同的植物中却表现出不少共性。如：具有极强的亲水性，在沸腾的缓冲溶液中仍保持溶解状态；具有比较简单的氨基酸组成，或少数几种氨基酸重复多次排列；许多还包含一段特殊的区域，能够形成亲水脂性的α—螺旋。如拟南芥的cor15a基因，它编码一种15kD的新多肽，合成后运送至叶绿体基质片层中加工成9.4kD的成熟多肽，称为COR15am〔5〕。COR15am是高度亲水性的，在沸水中仍保持溶解状态。它富含Ala、Lys、Glu和Asp残基，占整个蛋白组成的60%以上，不含Pro、Met、Trp、Cys、Arg、Gln和His残基，而且整个COR15am蛋白是由一个由13种氨基酸组成的序列重复4次排列组成。 2 抗冻基因产物的功能 植物在低温驯化过程中诱发合成的蛋白在抗寒中的作用可分为3类：（1）行使酶的作用，催化合成一些关键渗透调节物质，如脯氨酸合成酶，或是降解冰冻诱导的变性蛋白，为新蛋白的合成储备原料，如巯基蛋白酶类；（2）新合成的蛋白质附着于膜表面或位于膜脂间，对膜起冷稳定作用，如LEA蛋白等；（3）作为在信号转导和低温诱导基因表达过程中起调节作用的蛋白质因子，如CBF1等。以下就目前研究深的拟南芥的COR基因和植物AFPs 在抗寒中的功能作一介绍。 2.1 拟南芥的COR基因 在拟南芥所有高效表达的冷相关基因中研究最多的是COR基因，又称LTI基因，KIN基因，RD基因或ERD基因〔5〕。COR基因由四个基因族组成，每个基因族又是由两个基因一前一后串联组成。其中COR78，COR15和COR6.6家族的偶基因编码新发现的多肽，而COR47家族的偶基因则编码LEAII类蛋白的类群蛋白。而且Thomashow〔5〕和Hughes等〔3〕的研究还表明COR15家族的COR15a基因是与其它COR基因相互作用而提高植物的抗寒性的。 拟南芥的COR15a基因在低温，干旱及受脱落酸（ABA）诱导的胁迫中都表达〔5〕。如前所述，它编码一种15kD的多肽，在输入叶绿体基质片层中后加工成9.4kd的成熟多肽(COR15am)。为了鉴定COR15a基因是否具有抗冻性，Artus等〔6〕构建了一种组成型表达COR15am多肽的转基因植物，并将这种未经低温驯化的转基因植物与野生型植物的叶绿体的耐冻性进行比较的结果表明，它含有COR15am多肽的转基因植物的叶绿体耐冻性比不含有COR15am多肽的野生型植物的叶绿体提高了1～2℃。而且COR15am的作用不仅仅限于叶绿体。同样从这种未经低温驯化的转基因植物的叶片中分离出的原生质体,其忍耐低温限度也由-4～-8℃提高到-5～-9℃。同时Artus等〔6〕用双醋酸荧光素染料检查原生质体存活率的实验表明，COR15a基因的表达可以稳定膜的结构。但这种作用只局限于-4～-8℃ ，当温度在-2～-4℃范围内时，原生质存活率明显下降。而Steponkus等〔7〕发现，在-4～-8℃低温下所造成的膜系统伤害主要是由于形成了六角形II相脂，因此Artus〔6〕推断COR15a基因的表达可减少膜遇冷时所产生的由脂双层向六角形II相转变的发生率，但对“膨胀诱发的细胞破裂”很少或几乎没有作用。 目前，对COR15a基因在提