紫外吸收法测蛋白质含量.pdfVIP

紫外吸收法测定蛋白质紫外吸收法测定蛋白质 紫外吸收法测定蛋白质紫外吸收法测定蛋白质 含量含量 含量含量 一、一、基本原理基本原理: 一一、、基本原理基本原理 • 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸 残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有 吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长 附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量 （范围是 0.1~1.0mg/ml ）成正比，因此，280nm的吸光度 可用作蛋白质的定量测定。但不同种的蛋白质对 280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含 量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对 照，结果才可靠。在半定量测定和纯蛋白的定量 测定时，可用280nm的光吸收法。 • 基本原理基本原理 基本原理基本原理 此外，部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸、 核苷酸和碱基等物质在紫外区也有强的光吸收， 常与蛋白质类相互干扰。但二者的紫外吸收特性 不一样，由于核酸类物质在260nm有最大吸收 值，因此，可利用蛋白质280nm和260nm 的吸收 差法来测定计算蛋白质浓度。 紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓 度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备 及其它研究中应用广泛，尤其是适合于柱层析分 离中蛋白质洗脱情况的检测。 二、二、试剂和器材试剂和器材 二二、、试剂和器材试剂和器材 1．标准蛋白质溶液：准确称结晶牛血清白蛋白， 配制成浓度为1mg/ml的溶液。 2 ．待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质 溶液。 3. 紫外分光光度计 4.移液枪 5.试管和试管架 6.吸量管 三、三、操作步骤操作步骤 三三、、操作步骤操作步骤 （一）280nm 的光吸收法 （1）标准曲线的绘制: 取8支试管，编号后按下表加入试剂 号 1 2 3 4 5 6 7 8 试剂(ml) 标准蛋白质溶 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 液 4 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蒸馏水 蛋白质浓度 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0 （mg/ml） OD280 (2)样品测定(2)样品测定 (2)(2)样品测定样品测定 取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混 匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度 值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。 (二二)280nm和和260nm的吸收差法的吸收差法 二二 和和 的吸收差法的吸收差法 将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2至2.0 之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶剂作 空白对照，分别测得待测样品的光密度值 （OD280和OD260 ）。应用280nm和260nm的 吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。 蛋白质浓度 （mg/ml）=1.45OD280-0.74OD260