附— 实验实习指导.doc

附— 实验实习指导 实习一、动物染色体标本的制备与观察 一、实习目的： 1.初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。 2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。 二、实习原理： 凡细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂的任何动物组织，均可用于染色体分析。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。 三、实验用品 1.材料 小白鼠、无尾两栖类蛙属或蟾蜍属动物。 2.器材 水平离心机、显微镜、刻度离心管（10m1）、注射器（1ml）、载玻片、烧杯（400m1）、量筒（100m1）、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管。 3.试剂 (1)2%柠檬酸钠溶液：称取2g柠檬酸钠（柠檬酸三钠，Tri-sodium citrate,AR）溶解于100ml蒸馏水中。 (2)1%柠檬酸钠溶液。 (3)500ug/ml、100mg/m1秋水仙素（cochicine）溶液。 (4)Giemsa（姬姆萨）原液（pH6.8） Giemsa染粉（Giemsa stain） 1g 甘油（丙三醇，glycerine,AR） 31ml 甲醇（methyl alcoholA,AR） 45ml 将染粉倾入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨直至无颗粒为止，此时再将全部剩余甘油倒入，放入60~65℃保温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。 (5)0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8） Na2HPO4·12H2O 11.81g （或Na2HPO4·2H2O 5.92g） KH2PO4 4.5g 溶解于蒸馏水中至1000ml。 (6)1:10Giemsa磷酸缓冲液染液（pH6.8）。 (7)甲醇（AR）。 (8)冰醋酸（Acetic acid glacial,AR）。 (9)0.4%KCl（potassium chloride,AR）溶液。 四、实习内容 1.小白鼠骨髓细胞染色体的制备方法 (1)动物按4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3~4h后杀死动物。 (2)取出动物后肢的胫骨和股骨。剪去两端。 (3)将0.6~1ml2%柠檬酸钠用1ml注射器按上5#针头注入骨髓腔，将骨髓细胞先冲入小碟内，取下注射针头，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入10ml离心管。 (4)视骨髓量之多寡加入0.4%KCl溶液8~10ml，随即将离心管置37±0.5℃水浴中低渗10min。 (5)以1000r/min离心8min。 (6)弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配置的甲醇:冰醋酸（3:1）固定液5ml，加固定液时注意不要冲动细胞团块。 (7)加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻打均匀，静置固定20min。如此反复固定2~3次，每次20min。 (8)固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。 (9)在干净、湿、冷的载玻片上滴2~3滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干（在空气干燥的地方可不用）。 (10)将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1:10Giemsa磷酸盐缓冲液3~4ml，染色10min。 (11)在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸缓冲液，用小块纱布擦干玻片底面及四周，显微镜观察和分析。 2.黑斑蛙或蟾蜍骨髓细胞染色体标本的制备 (1)动物按30ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，7~8h后杀死动物，取出肢股骨和胫骨，用纱布剥掉全部肌肉，剪去胫骨和股骨两部。 (2)将1ml1%柠檬酸钠溶液用1ml注射器通过5#针头注入骨髓腔，细胞冲入小碟内。 (3)摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。 (4)将骨髓细胞转入离心管，视骨髓细胞量之多寡加入事先预热至26±0.5℃的0.4%KCl溶液8ml，置26±0.5℃水浴低渗30min。 (5)以后的固定、滴片、染色、观察、分析同“小白鼠骨髓细胞染色体的制备”。 五、观察 1.在低倍镜下观察Giemsa染色之后的中期分裂相的形态。在显微镜下可观察到染色体被染为紫红色。 2.在高倍镜下选择分散适度，不重叠的染色体