FCM 基础.ppt

流式细胞仪基础知识 北京市道培医院 流式细胞室 王卉 做免疫分型的基本要求 流式基础知识 免疫学基础知识：细胞表达标志 血液病诊断标准 流式细胞室对技术员基本要求 数据录入，文件归档管理 抗体和试剂配制 仪器的基本维护 标本操作 Calibur上机获取数据 数据网络传输 CD34、免疫功能检测 流式细胞仪器 什么是 FCM ？ Flow Cytometry(-er): 流式细胞术(仪） 流式细胞仪：一种对快速液流中的细胞进行分析（分选）的高科技仪器，组成：光路+液路+电路（+单抗技术+免疫学+专业知识） 白血病免疫分型：利用流式细胞仪判断细胞性质，以及与其他细胞的关系，根据血液病诊断标准，做出诊断的实验技术。是MICM诊断中的重要一项。 流式细胞仪的结构 光路： 1、激光光源及光束成形系统： 2、光学系统： 液路：流动室及液流驱动系统 电路：信号检测与分析：PMT、补偿电路 存储、显示、分析系统：计算机 细胞分选系统 自动显微镜？ 细胞看表面或者胞浆特异性抗原 流式细胞仪检测步骤 选择抗体与组合(panel) 标本制备 荧光标记 获取细胞 结果分析 荧光标记 FSC – 细胞大小、表面积（折射指数） (2) SSC – 颗粒性、结构复杂性 (3) 荧光标记 一维直方图 二维点图 标本处理 标本种类 各种活细胞标本 外周血、骨髓、脐带血 组织活检或者穿刺标本 体液 培养细胞 标本保存和运输条件 低温 血液标本抗凝 非血液标本悬浮于培养基或者生理液中 快速送检。 标本处理 BM、PB、采集物、脐带血等标本直接使用 体液标本：离心、浓缩后使用 组织标本：研磨，200目滤网过滤 特殊情况：提取单个核细胞 密度梯度离心 细胞计数 细胞标记 膜标记 细胞+抗体，孵育15分钟。 裂解红细胞 ABS 洗一遍。 加入0.5ml ABS，上机检测。 胞浆标记 膜标记 裂解红细胞 根据不同厂家说明书加入破膜剂 加入胞浆抗体 洗涤 上机 上机检测 略 免疫学基础：抗体 流式识别细胞-根据抗体 抗体种类： CD：CD1—CD363，其中还有很多有亚类 非CD分子：百余种，甚至更多 看人看特征 CD命名机构：Human Leucocyte Differentiation Antigens,HLDA工作组 Barcelona 2010：HLDA 9， 17个 为什么要做流式？ (1)得到精确诊断： 江山易改，本性难移——肿瘤可以模样改变，变得不易识别，但是基本免疫学标志不会改变，流式最擅长定系、定阶段、定良恶性 (2) 精确的生物学特点，便于监测：幼稚细胞5%，正常？异常？或者增生低下的标本流式可以找到独特表型，收集大量细胞，进行低频、少量细胞检测 (3) 识别潜在治疗靶位：抗体治疗 (4) 帮助进行预后分层：儿童ALL已经把8天PB，29天BM MRD定为重要的预后标志 北京市道培医院开展项目 各种血液淋巴肿瘤免疫分型（包括PTLD） 免疫残留（必要时做磁珠分选加强灵敏度，或者分选后结合其他方法） 组织标本的免疫分型与残留检测 非造血系统肿瘤骨髓侵犯的免疫分型检测 CD55/CD59/FLAER检测 肿瘤细胞DNA倍体分析（三色） NK细胞颗粒酶穿孔素检测，噬血综合征筛查 免疫功能 CD34+干细胞检测 干/祖细胞：34，TdT 髓系： cMPO， 33，13， 117, 15，11b，16 14，64， 11c, 36, 红系：71，glyA(CD235a), 36 巨核系：41a，61, 42b B 细胞： cCD79a, 22， 19， 10，20，k，?, cIgM T细胞： cCD3, 2，3，5，7，4/8， TCRab, TCRrd NK细胞：16，56，（3 ? /56+） 浆细胞：138，38，ck，c? 系别相关标志 * * 流式细胞术的发展史 1934年发现细胞在显微镜载物台的毛细管中流过。 1949年发现流动的悬浮粒子计数方法—Coulter效应。 1967年发展了一种液流束、照明光轴、检测系统三者垂直的流式细胞仪。 1974年美国Becton Dickinson公司（BD公司）推出第一台商品化流式细胞仪 80年代出现了完善的流式细胞仪。 检测悬浮的细胞（颗粒） 多数情况下，检测活细胞 一般机型目标物可以是细胞、细菌或各种微粒，0.5um~50um范围内，少数0.2um～150um 检测细胞的大小、颗粒性、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。 根据所规定的参量，把指定的细胞亚群从整个细胞群体中分选出来。 检测范围： 废液 检测和计数 样本 FSC 大小 SSC 颗粒性 荧光染色：膜/浆标志物 染色:细胞结构和化学染色 激光 光源 流动室 载物台 流式 显微镜 CD34 CD117 CD33