靶向bcl2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立_医学论文.docVIP

靶向bcl基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立_医学论文 靶向bcl基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立_医学论文 作者：沈方臻 林明刚 肖文静 王宁宁 【摘要】 目的 构建针对bcl基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体，转染到bcl基因高表达的胃癌细胞株SGC中，并筛选出稳定低表达bcl基因的细胞株。方法 针对bcl基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列，插入质粒载体pGPH1／GFP／Neo中，经脂质体介导转染SGC细胞。RT检测bcl基因在mRNA水平的变化, MTT 法检测bcl基因沉默后胃癌SGC细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果 与对照组相比，转染成功后的细胞bcl基因在mRNA水平均显著下降， 细胞增殖速度明显降低（t=2.41,0.05）并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl基因的SGC细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。 【关键词】 基因,bcl；RNA干扰；质粒 　　［ABSTRACT］ Objective To construct a short, bclairs of oligonucleotide specific for bcl2 gene were designed, synthesized, and inserted intopGPH1/GFP/Neo plasmids. The vectors were transfected into SGC7901 cells with lipofectamine. RTPCR was used to detect bcl2 gene expression and MTT technique employed to detect the proliferation of tumor cells after bcl2 gene was silenced. Cells with the strongest inhibition were selected with G418 and the stable cell clones obtained. Results As compared with the control, themRNA expression of bcl2 in the transfected cells was significantly suppressed, the rate of cell proliferation was significantly reduced(t=2.41,0.05). Conclusion SGC7901 cell strains, which express stable and lower level of bcl2 mRNA, were successfully obtained by using bcl2targeting shRNA plasmid vector. The present study provided basis for research on gene therapy of gastric cancer. ［KEY WORDS］ genes, bcl 　　bcl基因具有多种生物学功能，不仅参与抑制细胞凋亡，同时又是一个独立的耐药基因[1。阻断或下调bcl基因的表达可以促进肿瘤细胞凋亡，增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，从而达到提高肿瘤治疗效果的目的[3]。RNA干扰(RNAi)技术是近年来新兴的特异性基因阻断技术，能高效特异地封闭内源性基因的表达，使细胞表现出特定基因表型的缺失[4。本研究构建针对人bcl短发卡RNA(shRNA)表达重组体，通过脂质体介导的转染方法将重组质粒转入人胃癌SGC细胞，观察并检测转染后细胞bcl表达，筛选出能够稳定表达shRNA的细胞株，为进一步研究bcl对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及研究bcl基因功能奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料及试剂 胃癌细胞株SGC购自中国科学院上海细胞生物研究所； 脂质体 Lipofectamine 2000、细胞总RNA提取试剂购自Invitrogene公司；RT试剂盒购自宝生公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；上下游引物由上海生物工程有限公司合成。 　 　　1.2 方法 　　1.2.1 靶向bcl基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGPH1／GFP／Neo的特点，使用BLAST将选定的序列和相应的人基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列ST同源的序列