靶向HER2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究_医学论文.docVIP

靶向HER反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究_医学论文 靶向HER反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究_医学论文 【摘要】 目的 研究以HER2 mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（S）HA6722对HER过表达乳腺癌细胞株MDA体外增殖的抑制作用，及HA6722对肿瘤细胞HER表达的影响。方法 选择HER2过表达的MDA细胞与HER2低表达的MDA细胞，MTT法观察S对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（ICC）与RT方法研究S对细胞HER2蛋白及mRNA表达的影响。结果 HA6722可以剂量依赖方式抑制MDA细胞的体外增殖，IC50值（41.8±8.1nmol·L-1, n=5, mean±s）显著低于对照序列Scramble6722（IC50=489.4±12.1nmol·L-1, n=5, 0.01）。HA6722在蛋白水平与mRNA水平显著抑制MDA细胞中HER的表达；HA6722对MDA细胞的体外增殖无显著影响（IC50=476.7±17.6 nmol·L-1, n=5，P＞0.05）。结论 HA6722可序列特异性地抑制HER过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞HER表达下调有关。 【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 HER2 mRNA 0 引言 乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。HER2/neu（又称CerbB）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。现已明确，HER2/neu基因的异常扩增或HER2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mRNA，激活RNase H，降解mRNA, 阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3], 反义寡核苷酸可以抑制HER2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的HER2特异性硫代反义寡核苷酸HA6722，观察了其对不同HER2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mRNA和蛋白水平观察了其对HER2的影响。 1 材料与方法 1．1 细胞系及培养 本研究采用的细胞株有：MDA（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco,BRL）内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDA31（HER2低表达）的体外培养采用RPMI（Gibco,BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。 1．2 硫代反义寡核苷酸的合成 靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下： HA6722： 5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′ Scramble: 5′TCG GGC TGG CTC GGC TGC TG3′ 琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L或RPMI培养基溶解成浓度为25μmol·L－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。 1．3 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞活性 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar,USA）,接种数量分别为：MDA孔、MDA1 2×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722, Scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl, 细胞在37℃，含有5 %（MDA细胞的培养不需CO2）的培养箱中继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。 1．4 免疫细胞化学 以脂质体（LipofectamineTM 2000, Invitrogen）2000将终浓度为200 nM 的HA6722, Scramble6722对照序列转染MDA及MDA后，以免疫组化方法检测HER2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4M枸橼酸二钠，pH 6.0)中以 95℃ 15min进行抗原修复，室温下冷却20min，用Tris 缓冲液（pH 7.6）冲洗涂片3min×3次，然后过氧化氢室温封闭5min，再按上述方法洗涤。涂片在37℃下用HER2单克隆抗体(鼠抗人，Santa Cruz, USA)孵育60min，再用二抗 (羊抗鼠，Santa C