骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增_医学论文.docVIP

骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增_医学论文 骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增_医学论文 作者：彭磊　王臻　王庆良　王鹏飞　胡蕴玉　吴银松 【关键词】 骨肉瘤 关键词: 骨肉瘤T淋巴细胞，细胞毒性体外扩增 摘 要:目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测. 方法 抽取骨肉瘤患者自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性. 结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8+ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用. 结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果. 　　Keywords:osteosarcomaCTLproliferation in vitro 　　Abstract:AIM To induce the osteosarcoma specific CTL proliferation in vitro.METHODS We isolated T lympho-cytes from peripheral blood of osteosarcoma cases，which were previously dealt with docitaxol，and activated with com-bination of macrophages and interleukin-2（IL-2），then their tumor-killing ability was measured.RESULTS A large number of lymphocytes that proliferated after3d mixed cul-com ture were proved mainly to be CD8+ T cell by FCM，and their tumor-killing ability was great in vitro.CONCLUSION The specific CTL proliferation in vitro by mixed culture of macrophages，host tumor cells and lymphocytes under the presence of IL-2is a prospective way in the immunological therapy of tumor.It may improve the therapeutic effect of osteosarcoma. 　　0 引言 　　免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要辅助方法，已确认机体免疫监视功能中起重要作用的是细胞免疫，其中起特异性杀伤作用的是细胞毒T淋巴细胞（CTL），CTL具有特异性高、杀伤性强等特点，故有重要的临床应用前景，成为新的研究热点，但此研究在骨恶性肿瘤尚属起步阶段.我们应用自建系的骨肉瘤细胞系PL-992与患者自身淋巴细胞及巨噬细胞体外混合培养（MTLC），扩增出大量淋巴细胞，并对这些淋巴细胞进行生物学特性测定. 　　1 材料和方法 　　1.1 骨肉瘤细胞系PL┐991来源及预处理 手术无菌切除新鲜活力好的骨肉瘤组织，病理诊断为骨肉瘤骨母细胞型，接种裸鼠皮下，待肿瘤长出后，组织块培养法，体外传代建系并进行生物学特性测定.用6mg L-1 多西紫杉醇处理48h后与淋巴细胞体外混合培养. 　　1.2 自体淋巴细胞的分离 抽取骨肉瘤患者外周血4mL，淋巴细胞分离液（购于Sigma公司）1500g离心15min，分离淋巴细胞（1×106 ），培养于200mL L-1 小牛血清RPMI1640的完全培养液中. 　　1.3 特异性杀伤性T淋巴细胞的体外刺激诱导 用班蟊液获得患者自体的巨噬细胞加入用IL-2（上海华新生物高技术公司）150U mL-1 ，植物血凝素预刺激36h的淋巴细胞，同时加入1/8的多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞PL-991，37℃50mL L-1 CO2 条件下培养，细胞计数，并在倒置显微镜下观察. 　　1.4 流式细胞仪增殖T淋巴细胞检测 取2×106 mL-1 待测细胞加入U型孔内，再加入CD3+ CD4+ CD8+ 单抗，每孔各20μg，4℃孵育30min，应用免疫荧光和流式细胞仪测定淋巴细胞CD3+ +CD4+ +CD8