草菇Volvariella+volvacea+rDNA特异性扩增片段的RFLP的探究.pdfVIP

第三届环境模拟与污染控制学术研讨会论文 革菇物，帽厂?e／，占∞，旧c日ar醐A特异性扩增片段的RFLP研究 余志晟“：，吕作舟2 t诸华大学环境奉}学sI程系环境模拟s污葵!控裁鼠家重点实验室?毙京 l∞084：2华中农业大学直罱真菌研究所．武投430070 在真菌中，核1．D№以多拷贝串联重复单元存在于染色体上，它包括18s、 5．8S、 transcribed 28S、和5SrDNA及其间隔区域ITS(internalspacers)， 由于rDNA的保守基因序列和可变基因序列进化速率不同，因而对于它的探测可 于动物线粒体DNA和植物线粒体DNA大小之间，它的组成类似于原核生物的rDNA。 近年来，真菌核rDNA及线粒体DNA已运用于真菌分类鉴定和系统发育的研究， 但在草茹生产菌株分类鉴定方面，还未有报道。本文对中国12个主要草菇栽培 small)rDNA的两个区段进行了PCR扩增和RflL}’ 菌株的ITS和Ms(mitochondrial 研究， 以便为草菇高产生产菌株的选育提供依据。 l材料与方法 1．1实验菌株(详见表1) 表1供试菌株 1．2DNA提取、PcR扩增及其产物检测 增反应程序为94℃预变性5min后进行30个循环，包括94℃变性30秒钟，50℃ 复性30秒，72℃延伸1分30秒，72℃补平5分钟，所用引物为 泳检测反应产物及其分子量大小。 1．3限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP) nI、HaeⅢ、Hinf、、deI、 对ITS和Ms的rD溉扩增产物分别用酶NLaIV、Taq 一Z8一 第三靥环境模拙与污染控制学术研讨会论文 p RsaI、sau3^进行酶切分析。取反应产物10l于O．5m1的EP管中，加入2p】 p 相应的反应缓冲液，8U的酶，用双蒸水补足到201，置水浴中4小时，永浴温 度按说明书进行。反应结束后，加4pl溴酚兰指示荆，接着在3％琼脂糖擞胶中 2结果 2．1 PcR及其产物 体小rDNA区域的特异性单一片段，而在阴性对照中，均未扩增出任何片段，表 明整个反应没有外来污染。ITs区域的扩增片段大小在12个菌株中均相同，约 为720bp。线粒体小rDNA的扩增片段大小在12个菌株中也表现一致，约为690bp． 表明在草菇菌株的这弧个区域中都设有发生较大的长度突变。 2．2 ITS_RFLP分析 o 采用的七种酶(N1aIv、Taq 除NdeI外，其余六种酶都能对特异性PcR产物产生消解反应。HinfI．sau3A—RF归 结果表明，供试的12个菌株在这两种酶的酶切图谱中分别表现为两种基因型， 它们将供试菌株一致地分为两类，～类为菌株1、3、4、5、6、7、8、9、10。 160bp、110bp。 460bp、340bp、250bp、230bp、210bp、 2．3线粒体小rDNA—RFLP分析 采用的七种酶同2．2，陈NdeI，Sau3A不能外，其余5种酶都能将PcR产物 部分酶切，其图谱都没有展示出菌株在线粒体DNA水平的多态性，其中N1aIV I的酶切片段大小为260bp、390bp， 的酶切片段大小为140bp、j50bp，Taqa o 只有一个酶切位 得的图谱看，NlaIv，TaqI，HaeLU，RsaI的酶切位点保守， 点，HinfI能识别六个酶切位点。 3讨论 综合对ITs区和线粒体小rDNA区的特异性扩增和酶切分析结果，并结合我 们已经研究报道的RAPD分析和同工酶分析结果，发现国内使用的主要草菇栽培 菌株存在一定