藻酸钙凝胶复合载体骨骼肌内成骨地研究.pdfVIP

藻酸钙凝胶复合载体骨骼肌内成骨的研究 1 1 2 1 谈伟强 徐靖宏 林 军 虞渝生 浙江大学医学院附属第一医院 1 整形外科 2 口腔科（310003） 摘要 目的：观察一定接种密度的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell, BMSC ）的加入对 rhBMP-2/藻酸钙凝胶复合载体在骨骼肌内异位诱导成骨的影响。方法：以低粘度藻酸钙凝胶为载体， 实验组复合1.0mg rhBMP-2 （recombinant human bone morphogenetic protein 2 ，人类基因重组骨形成 蛋白-2 ），对照组复合第二代自体BMSC 以及相同剂量的rhBMP-2 。两组载体复合物均在兔股内侧肌 下埋置。4 周时，用X 线观察两组成骨情况；2 、4 、6 周取材后以ALP 染色、Von Kossa 染色、HE 染色分别观察两组标本成骨活性、组织钙化及新骨组织形态；并分别对两组6 周时形成的新骨组织 进行骨小梁面积计量。结果：藻酸钙凝胶复合rhBMP-2 组和复合rhBMP-2+ BMSC 组均在4～6W 形 成新生骨组织，两组标本均为编织骨形态，AKP 染色、Von Kossa 染色提示成骨过程相似。两组相 比，成骨率及骨形态计量均无显著性差异。结论：应用骨骼肌异位诱导成骨原理，通过rhBMP-2 复 合载体的置入，可以简易有效地形成一定体积的新生骨组织，成骨过程中无需加入外源性BMSC 。 骨骼肌中含具有成骨潜能的间充质干细胞，在骨形态蛋白-2 （Bone morphogenetic protein 2, BMP-2 ）的诱导下，通过细胞的分化、增殖、基质矿化，可以形成新生骨组织，诱导形成的骨组织 具有自体松质骨的形态结构。骨骼肌是复合载体的成骨受床，为异位成骨提供了良好的环境。为观 察一定接种密度的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell, BMSC ）的加入对rhBMP-2/藻酸钙凝胶 复合载体在骨骼肌内异位诱导成骨的影响，进一步探寻合适的支架材料，我们以藻酸钙凝胶作为人 基因重组骨形成蛋白-2 （recombinant human BMP-2, rhBMP-2 ）及骨髓基质细胞（BMSC ）的载体， 在兔股内侧肌中构建骨组织。 1 材料和方法 1.1 材料 新西兰白兔 12 只，4～6 周龄，体重2.0～2.5KG ，雌雄不限。随机分成两组，每组各6 只。分 析纯低粘度藻酸钠购于Sigama 公司。rhBMP-2 购于华东制药集团基因研究所。 1.2 rhBMP-2+BMSC 组 1.2.1 BMSC 的获取和培养 该组白兔分别以速眠新（0.1ml/kg ）肌注麻醉，以肝素抗凝处理过的16 号穿刺针于兔股骨第三 转子下抽取骨髓1～2ml ，置于含10ml α-MEM 完全培养液（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链 霉素 100U/ml）的离心管中，2000 转/min 离心，去除脂肪成分后接种于培养皿，于 37℃、5%CO2 及饱和湿度条件下培养，第5 日首次全量换液，以后隔日换液。待细胞生长至80～90%汇合时，用 0.1%胰蛋白酶＋0.02% EDTA 消化（37℃、3～5min ），按1:3 传代培养，收集第二代细胞用于实验。 1.2.2 藻酸钠溶液的制备 244 藻酸钠溶于含有0.15M NaCl 的溶液中，使藻酸钠的质量分数为1.2%，磁力搅拌机搅拌，PH 值 调为7.4 ，高压蒸汽灭菌备用。 1.2.3 藻酸钙复合BMSC 和rhBMP-2 6 份BMSC 分别复合。第二代BMSC 消化后，1000 转/min 离心 10min 浓集，进行细胞计数， 然后加入1.2%藻酸钠溶液使细胞密度为4.0×106/ml ，吸入10ml 注射器中，加入1.0mg rhBMP-2 混合 均匀。再将此混合溶液缓慢滴入40ml 的102mM CaCl 溶液中，立即交联形成凝珠，室温下反应10min 2 以达到最佳交联效果。吸出CaCl2 溶液，用0.15M NaCl 溶液反复冲洗4 次，α