老年性痴呆患者血浆中生物标志物地研究.pdfVIP

trey Forea衄the 2005China-Japan却mposi啦佃CerebralPatsyttechnolo盯of卫ehabilitlti∞ 2QQ5生旦膻瘥堂丕窑逾太金墅鏖复堑挂盔论坛 老年性痴呆患者血浆中生物标志物的研究 代蓉 昆明医学院第一附属医院康复理疗科 硎f要J目的：检测阿尔茨海默房(AD)患者血浆中的氧化蛋白．方法：通过二维电泳法分离AD患者 血浆和年龄相对应的健康对照组的血浆后，并与2。4．硝基酚肼∞N呻结合，用抗．DNP的抗体做免疫荧光染 色来检测氧化蛋白．用MALDI_质谱法做蛋白质测序．结果：实验显示氧化蛋白是纤维蛋白原T链的前身． 和al抗胰蛋白酶的前身是同源蛋白．AD患者血浆中的氧化蛋白是健康对照组2-6倍．结论；氧化蛋白质参 与AD的病理构成，是AD患者诊断的生物标志物． 【关键词】蛋白质氧化；纤维蛋白原T链；n1抗胰蛋白酶血浆蛋白；老年性痴呆；生物标志物 由反应性氧化物(ROS)引起的氧化损害是神经系统退变性病一一阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)的主要发病机制，氧化蛋白质堆积在AD患者脑组织中神经元退 变的部位上。实验证实，在AD患者的血浆中也发现了这些相同的氧化蛋白，氧化导致蛋白 质多肽裂解，交叉连接，氨基酸的侧链被修饰．最后失去细胞的基本功能，并产生细胞毒性堆 积，蛋白质氧化的易感性依赖于蛋白质特殊结构，氧化敏蛋白质已被认为是潜在的AD诊断 的生物标志物，最普通的定量氧化蛋白的方法是通过检测与DNPH结合的羰基数量。在AD 患者脑组织中，能与DNP结合的氧化蛋白质是AD患者组织病理学的生物标示物。在实验中， 我们已用：维聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AD患者血浆中总蛋白和特殊的氧化蛋白。并用 MACDI-质谱测序这些AD患者血浆中的特殊的氧化蛋白质． 1材料和方法 抽取诊断为AD的患者，70_89岁，9例，其中2例尸解确诊为AD。健康无痴呆对照74-89 岁．9例，血浆lOml。装于EDTA直空管中，离心15分钟，分离出血浆，取少量分装并稀释 至5mg／M．藏于一80C下备用。蛋白质浓度用BCA法测定。 Gradient)胶 取150Ⅱg血浆蛋白放于pH4．7、l,$mM等电点电泳IPG(Lramobilized pH 条上．电压24．00V／h电泳后．加DNP使之与氧化蛋白质结合，用Conrad等方法Ⅲ。然后一 个样品--{9配对放入两个9％-15％SDS-丙烯酰胺梯度凝胶．做二维电泳。一个凝胶用银染法 [2-41。银染后蛋白质显影，用ScanMaker于400×400分辨率下成像． 另一个凝胶上的蛋白用电印迹法转移到PVDF膜上．然后进行免疫荧光染色。1：16．000 的抗DNP抗体，1：16,00羊抗兔第二抗体，用CCD成像系统成像．成像上的蛋白斑点用 2005 IForm∞tim№t bhabilltati∞ T∞holo盯of CM聃．J叩皿Symt州mm∞Cerebral^by 2QQ5生目膻瘗堂盔窑速太会暨崖复缸控苤监坛 下来，并用MACDI质谱法进行蛋白测序．一 2结果和讨论 为检测AD患者血浆中特殊氧化蛋白的特性，用二维电泳分离AD患者和非AD对照组 的血浆蛋白质。并用免疫染色法探测蛋白质羰基．免疫染色DNP-抗体探测出的氧化蛋白质最 突出的有7个氧化蛋白斑点(编号从a到q)，是pH4．7-5．5的等电点．45-60KD的分子量． 这些氧化蛋白质在AD患者及非AD对照组中都存在。然而AD患者的氧化蛋白质斑点强度 明显高于非AD的对照组。例如氧化蛋白斑点“Y”大约增加7倍。斑点。Ⅱ”“B”和“n” 高3-4倍．在蛋白质染色的图型中．检测到总蛋白300多个斑点。但只有不到20个斑点是抗 DNP抗原免疫染色测到的氧化蛋白