间接免疫酶组织化学与间接免疫荧光检测雏鹅人工滴鼻感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律的研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11攻学术研讨会 间接免疫酶组织化学和间接免疫荧光检测雏鹅人工滴鼻感染鹅细小病 毒后病毒在体内分布规律的研究 周春字l’2，程安春1,2，·，汪铭书1,2 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安625014；2．四川农业大学动物科技学院禽病防治研 究中心，四川雅安625014) 摘要：通过滴鼻感染1日龄未免疫GPV雏鹅，分别在不同的时间段内剖杀．取心、肝、脾、肺、肾、 大脑、肌肉、食道、腺胃、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠、胸腺、胰腺、法氏囊，利用已建立的间 分别在感染后8～576h内的不同时间点从心、肝、脾、肺、肾、大脑、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直 肠、胸腺、胰腺、法氏囊十四种组织器官中检测出病毒抗原。两个试验组的鹅在感染后4h、50d均不能从 体内检出病毒抗原，感染后144h病毒在机体内各组织的分布晟为广泛，在检测的组织中肝脏的检出率最 高，但均未能从肌肉、腺胃、食道中检山病毒抗原。IIS与IIF检测GPV感染后病毒在雏鹅体内的分布趋 势相同，仅在总体检出数上存在差异，但是IIS的阳性检出率要比IIF的检出率高，两种方法均可以用于 临床病例的检测。 关键词：鹅细小病毒，问接免疫组织化学。间接免疫荧光，动态分布规律 目前研究鹅细小病毒感染雏鹅的分布规律报道较少，主要有病理学方法【1=2J、PCR技术pJ等。这些方法 用于研究病毒在雏鹅体内的分布规律时有其各自的优点，但却不能用于GPV感染的组织器官和细胞的抗 检测细胞培养物和人工感染鹅GPV的研究；间接免疫酶组化法检测GPV还未见国内外相关报道。而国内 报道应用免疫荧光检测GPV的方法均为直接法15-71，未见用间接法研究GPV在雏鹅体内的分布规律； 断GPV，IFA可检测到GPV感染的鹅和鸭胚的绒毛尿囊膜细胞核和细胞质以及人工感染死亡鹅的心、肝 中存在GPV抗原，但没有进行系统的发病规律的研究。本研究通过滴鼻感染雏鹅，在已建立的间接免疫 组织化学和间接免疫荧光方法基础上。检测病毒在组织中的分布情况及分布规律，比较这两种方法的优缺 点，为临床筛选更好的诊断方法。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1‘实验毒株GPVoCHV强毒株由四川农业大学禽病防治研究中心分离保存。 I．I．2试验动物：1日龄无GPV母源抗体的四川白鹅雏鹅60只，四川农业大学实验动物室提供。 1．1．3试剂：兔抗GPV抗体由四川农业大学禽病防治研究中心制各：APES粘片剂购自武汉博士德生 4％多聚甲醛组织固定液。 有限公司：pH7．4 1．1．4主要仪器RM2128型切片机(Leica公司)；FEATHER JAPAN)；NickonE400显微镜及数码显微照相系统(Nickon公司)。 1．2方法 1．2．1 h、12 情况。分别于接种后4h、8 天剖杀组内。 8 家禽传染病 1．2．2切片制备：动物剖杀后，采集心、肝、脾、肺、肾、肌肉、大脑、法式囊、胸腺、胰腺、食道、 4％的多聚甲醛4C吲定48h，按常规病 腺胃、十_二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠共17种组织，用pH7．4 理要求系列酒精脱水、包埋，以APES做粘片剂制各4pm的石蜡切片。每个组织器官作连续切片4张．2 张按已建立的程序1．2．3进行IlS和程序1．2．4进行IIF染色。 后．用3％的甲醇．H202 洗涤2次；用0．01 10min 3次；滴加羊抗兔辣根过氧化物酶标抗体湿盒中3TC孵育45min。摇洗10min3次；滴加DAB湿盒中 显色1～2min，自来水冲洗．苏木素衬染5～8min。按常规石蜡切片制作方法脱水透明，封片烘干，显微镜观 察。 过夜后60℃烤15rain，O．01mol／L 色效果。 · 1．2．5结果的判定免疫组化结果判断标准：按照光学显微镜视野下观察到的特定细胞经染色后棕黄 色显色的有无、数量、种类及深浅来判定：①没有出现棕黄色细胞的判为阴性；②