猪瘟病毒E2蛋白4重复抗原表位的构建与抗原活性研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 猪瘟病毒E2蛋白4重复抗原表位的构建及抗原活性研究+ 张青婵，刘思国，徐兴然，余兴龙，涂长春 30062) (解放军军需大学军事兽医研究所，吉林长春，I SwineFeverVirus Viral 猪瘟病毒(Classical CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine Virus 猪瘟的发生，猪瘟是当前危害我国养猪业最重要的烈性传染病之一，是我国猪瘟防制研究的首要对象。 将CSFV与猪的BVDV感染区别开，这给猪瘟的防治带来了一定的困难。 异单抗WH303和多克隆抗体的反应性，首次发现在CSFV 后将单表位与4重复抗原表位基因分别在大肠杆菌进行了表达。最后通过动物免疫测定了单表位和4重复 抗原表位的免疫原性。结果表明单表位融合蛋白免疫家兔攻毒后能够廷缓和降低兔体发热，具有一定的免 1、材料和方法 酶切位点的CSFV 核表达载体pGEX一3X，购自Pharmacia公司。PIuDNA聚合酶，Taqplus 国家973计划(G19990I1903)和国家自然科学基金重大项目1)资助课题。 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 GSTPurification DNA Kit 公司，Microspin Module试剂盒购自Pharmacia公司，Gel 试剂盒，购自Roche公司。扩增抗原表位基因的引物由上海生物工程公司合成。 位点(斜体部分)和重复抗原表位基因5’端的一段序列组成。 抗原表位基因3’端的一段反向互补序列组成。 猪瘟阳性血清，用CSFV基因疫苗免疫猪，石门强毒攻毒得到保护后采血，分离血清而得。 学况彗星教授惠赠，是从无猪瘟感染和非免疫的SPF猪采血制备。抗兔酶标二抗和抗猪酶标二抗，购自 Sigma公司。 1．2方法 对，用Pfu 的重组质粒进行核苷酸序列测定(测序由上海联合基因科技有限公司完成)。序列正确的重组质粒命名为 pGEM一5ZF4P。 DNAPurification 和Sinai进行双酶切，获得目的基因片段，回收目的片段(按Gel Kit说明书进行)， BamHI／EcoRI双酶切鉴定，筛选重组质粒，命名为pGEX一3X4P。 1．2．3 再粘稠。422 一2022保存备用。 1．2．4 GSTPurification GST一4P表达产物的纯化及反应原性鉴定：纯化按Microspin 取纯化的GST一4P与猪瘟阳性血清、兔抗CSFVE2高免血清和兔抗BVDVE2高免血清进行间接 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 2M 分钟，加入50ulH。SO。终止反应，用酶标仪(Ek800)读取OD。。。值。 2、结果 2．1重复抗原表位基因的克隆与表达载体的构建：本实验所研究的4重复抗原表位的氨基酸序列为： G日0TAvsf叮TLRTEvⅥqsPGs|QTAvsPTTLRTEvⅥqsPG lLRTEVVK|NS。方框内为CSFV 后，1，5％琼脂糖凝胶电泳见有预计大小的目的条带。 2．2 PuHfication GST 化入大肠杆菌JMl09，通过IPTG诱导表达，表达产物用Microspin pGEX一3X4P转化后表达出了正确的GST一4P表位融合胥自。 2．3间接ELISA测定结果 高免血清有