反相高效液相色谱用于分离提纯工业合成小肽0—8肽地研究.pdfVIP

LC-122 反相高效液相色谱用于分离提纯工业合成 小肽O一8肽的研究 邹娟娟％3张庆合“3李彤“3王风云2张维冰1张玉奎 (1．中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011) (2．南京理工大学工业化学研究所南京210094) (3．大连依利特分析仪器有限公司大连116011) 用于分析和分离肽和蛋白质的方法多种多样，其中反相高效液相色谱(}IPRPc)被广泛 采用…，主要是由于它的高分辨率，它可以分离氨基酸序列几乎相同的肽和蛋白，如由胰蛋 白酶水解得到的小分子肽，结构上只相差一个氨基酸残基的胰岛素类似物”1等．目前许多小 分子多肽通过基团保护，接肽缩合等化学反应来人工合成．在此过程中不可避免的生成各种 中间体和类似物，为了获得高纯度的最终产品，必须采用多种分离提纯手段．而在产品的最 后提纯阶段．一般利用具有较高分离能力的高效反相液相色谱(HPRPC)来去除产品中的异 构体，类似物等用其他手段无法分离的杂质．本文研究的O一8肽是由化学合成的含有8个 氨基酸的碱性小分子肽，分子量1019．前阶段在分析柱上初步建立了分析方法，优化制备 条件。 l 实验部分 1．1仪器与试剂 依利特公司高效液相色谱仪，包括P200II高压恒流泵、P200II紫外可变波长检测器、 Echrom98色谱工作站；乙腈、二次蒸馏水、三氟乙酸，o-8肽样品 1．2色谱条件 oDs— 流动相：乙腈水溶液=27：73(O．1％TFA)；色谱柱：大连依利特Sinochrom BPlOum 20 4．6x250mm；流速lml／mim波长2nm；室温 2 结果和讨论 0—8肽是小分子肽，其在反相色谱中的保留模式介于大分子蛋白的吸附／解吸模式和 小分子物质的分配模式之间”1。本文重点研究了梯度条件，乙腈浓度，TFA添加量，等色谱 条件对分离的影响，优化分析条件，为工业产品提纯提供条件。 2．1梯度条件和乙腈浓度对分离的影响： 合成产物中含有的杂质结构和分子量与目标产物都非常近似，色谱保留时间比较靠近， 5 4 麓。 彘2 1 0 0 1 2 3 4 B％变化值(％／min) 图1．梯度变化速率对分离度的影响 346 较陡的梯度曲线条件下分离情况不理想，应用很缓的梯度(乙腈浓度变化每分钟在1％以 内)。 ODS—BPlOu 试验条件：色谱柱：SinoChrom 4．6×250mml流动相A：乙腈：水(0．1％TFA) =10：90B：乙腈(0．1％TFA)；流速lmI／min；波长：220nm：室温。 考虑到制备问题，可以选择等度条件。在等度条件下，适宜的乙腈浓度为27％。乙腈浓度 低于时27％(B％=19)，保留时间和半峰宽变化较大，浓度高于29％，分离度又下降，如图2 0 l 4 9 I 2 8 橱 1 髫 7 *6 08