猪体外成熟卵母细胞在冷冻保护剂中细胞膜的渗透性的探究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 猪体外成熟卵母细胞在冷冻保护剂中细胞膜的渗透性研究3 史文清4唐国梁朱士恩5 (中国农业大学动物科技学院北京市海淀区圆明园西路2号100094) 摘要：为了建立适宜猪卵母细胞冷冻的程序，本实验分析了体外成熟卵母细胞在不同冷冻保护 剂(CPAs)日渗通陛能。实验结果表明：卵母细胞在高渗的CPA溶液中，在60s内胞质内水分脱出， 大约10rain即可达到渗透平衡；猪卵母细胞渗透平衡稳定在80％一90％左右。实验证明猪体外成熟 卵母细胞有着不同于小鼠卵母细胞的渗透特性。 关键词：猪卵母细胞，冷冻保护剂，渗透 哺乳动物卵母细胞是母系遗传信息的携带者。猪卵母细胞冷冻保存不仅可以对我国优良猪种种 质资源加以保护，挽救濒危动物，达到资源长期保存利用、资源交换与共享的目的，而且对其他哺 乳动物卵母细胞冷冻生物学的研究具有重要的借鉴意义。但是迄今为止，猪卵母细胞冷冻保存的研 究仍尚未突破，还没有获得卵母细胞冷冻保存的后代；体外受精(IVF)的效果差n1；胞浆内精子注射 II期嘲 (ISCI)的囊胚率也较低‘2’鲫；猪卵母细胞冷冻后孤雌发育卵裂率也较低Ⅲ，最近才有MI删51M 卵母细胞玻璃化冷冻保存后得到孤雌囊胚的报道。 早有研究报道，猪卵母细胞与其他哺乳类卵母细胞有很大不同，其对低温很敏感，冷冻保存效 果不理想吲，许多学者对猪卵母细胞冷冻方法学以及冷冻损伤进行了研究n一·钔，但冷冻保存进展依 然缓慢。冷冻过程中，冷冻保护剂(CPA)的选择、卵母细胞膜的渗透性与冷冻保存的效果关系较大， 是否猪卵母细胞细胞膜渗透性存在特殊的特性影响了卵母细胞冷冻后发育能力，是成功玻璃化冷冻 卵母细胞的关键因素之一。但目前尚未有对猪体外成熟卵母细胞细胞膜渗透性分析的报道。 本研究主要探讨猪体外成熟卵母细胞对乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMS0)为基础的冷冻保护剂的 渗透性，为提高猪卵母细胞冷冻保存效果提供理论指导。 1材料和方法 Chemical 除特别说明外，本实验所用化学药品与试剂均购自Sigma Company(USA)。所有的试 l Gelman)过滤后使用。 剂配制后经0．2帅一次性滤器(Pal 1．1猪卵母细胞的收集与体外成熟 猪卵母细胞的收集和培养参考以往研究n伽方法进行。简单地说，采集青年母猪卵巢表面直径2～ EGF十10IU／mlPMSG+IOIU／mlhCG。成熟的44h的COCs移入含0．1％透明质酸酶的 半胱氨酸+10ng／ml 。．国家自然科学基金(项目编资助。 4史文清(1972．4--)，男，博士。 5通讯作者， 电话／传真：010电子信箱：zhushien@cau．edu．cn 145 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 1．2冷冻保护剂的配置 (pFF，自制)按照体积比例稀释而成。见下表。 1．3卵母细胞体积的估计与相对体积计算方法 DOs从等渗透压的溶液进入高渗的CPA溶液后，形态发生的变化示意如下： 卵母细胞体积变化的估算通过球体体积公式，矿一13兀rk勤2)， ％L岛／ h落L凡／ 一…龇罢=时黯=时 可见通过对卵母细胞垂直视野的面积估算，便可以估算出卵母细胞体积。再得到每一枚卵母细 胞再CPA中相对体积(relativevolume)变化的比值。 卵母细胞胞质面积的估算方法叙述如下： 中，吸入Imm左右气柱再吸入等渗溶液2mm左右防止卵母细胞丢失。在倒置显微镜下，通过口腔控 制的吸卵针准确移入培养皿中CPA液层(液滴较平，低于lmm)，薄层溶液上覆盖石蜡油，培养皿放 置于38．5。C恒温板上。移动吸卵针到适宜位置，轻轻吹出卵母细胞，使其落在显微镜视野中间。 导致显微镜物镜选用10×，图像放大1．5倍。视频图像打印机(Mitsubishi，ModelP90)连接于 安装在倒置显微镜(Olympus，IX70)的数码CCD图像采集器(