多重RT-PCR快速检测禽流感病毒地研究.pdfVIP

第五届中南地区实验动物科技交流会 论文汇编 多重RT—PCR快速检测禽流感病毒的研究 乔宪风，陈思怀，华文君，郑新民．魏庆信，刘西梅，周荆荣 【摘要】参考HI—H15亚型禽流感病毒(AIV)的核蛋白(NP)基因序列以反 m，H6，H9亚型AIV血凝素(HA)基因共设计四对引物，建立了用两对引物扩螬AIV 囊液、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)尿 囊液以厦三种亚型AIV尿囊液的2倍系列稀释样品进行RT—PcR并电泳检测。结果 表明，对三种亚型AIV尿囊液扩增均出现两条特异性条带，经测序确证为目的扩增片 段，说明该方法能检测此三种亚型AIV；对NDV、IBV、IBDV的RNA扩增未见目的条 带，判断为阴性，说明该法特异性强；能对三种亚型AIV尿囊液64—128倍稀释的样品 检测出AIV。表明灵敏度高。谊检测法检测的整个过程仅需4小时，实现AIV的快速 检测。 【关键词】禽流感；RT—PCR；诊断 禽流感对养禽业、人类公共卫生安全的严重威胁，因此倍受人们的关注…。为了尽早、准确的诊 Influenza 断本病，检测禽流感病毒(Avian Virus，AW)是关键。传统诊断方法有病毒分离、电镜观察、 足，如：检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、不能检测病死材料以及不适台对活禽市场环境和进出 口畜禽产品的大样本检测。随着现代分子生物学的发展，聚合酶链式反应(PCR)或反转录一PCR (RT—PCR)技术的应用实现AIV检测的快速、准确、灵敏。同时能对PCR产物的序列分析，便于对 —PCR反应主要根据扩增单基因进行AIV型或亚型诊断，目前未见报道在同一RT—PCR反应中作 出型和亚型同时诊断。本研究主要针对NP(型诊断)、HA(亚型诊断)基因建立两对引物多重RT— PCR检测方法，对我国主要报道的H5、H6、H9亚型AIV快速检测。 l材料与方法 1．1主要仪器及试剂 1．2病毒增殖对湖北畜牧兽医研究所保存的H5N1、H6N2、H9N2 AIV，新城疫病毒(NDV)、传染 的活胚的尿囊液。50009离心10rain，-20T：冻存。 170 论文汇编 第五届中南地区实验动物科技交流套 表1合成的引物序列 注：R=A／C，Y=C／T，M=C／C，W=A／T，K=G／T I．4 RNA加人75％乙醇，-20。C保存。 1．5 产物(eDNA)进行扩增。并调整反应条件和优化反应体系。 1．6 PCR产物判断对PCR产物琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小初步判定，回收预期条带( 粒，进行测序(上海搏亚公司完成)，并与Genebank注册序列BLAST。 向引物，PCR引物为4对引物的混合；阳性对照以4种经测序确证的阳性质粒等量混合为PER模板， 用4对引物的混合扩增。 别对H5、H6、H9AIV进行交叉RT—PCR检测，反应条件及体系同步骤1．5。 1．9灵敏度实验将三种亚型禽流感病毒尿囊液作2的倍比稀释，对每一稀释样品进行检测，其余 步骤同I．4，1．5。 2结果 2．1 RT—PCR反应 经多次调整反应条件，优化反应体系，按表2的条件体系可得到较好的检测结果。三组多重 H9条带，阴性无条带．NP、H5、H6、H9四条带同时清晰出现在阳性对照泳道，见图I。 17l 第五届中南地区实验动物科技交流套 论文汇编 图1对三亚型AIVRT—PCR产物电泳图 1Mmkcr 5阴性对照6阳性对照 2，3，4分别为H5，H6，