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在动物转基因中锌指核酸酶技术的应用 　　动物的转基因技术是建立在分子生物学基础上，利用基因工程等试验方法将外源基因导入动物的受体细胞，并通过受体细胞的分裂与繁殖，将整合在受体细胞基因组中的目的基因有效遗传给后代个体，并得到预期结果的一种方法。该技术始于２０世纪８０年代，１９８０年Ｇｏｒｄｏｎ等［１］通过核显微注射技术在小鼠体内的试验，成功获得了第一个转基因动物。后来一些研究人员又利用该方法陆续在兔、绵羊、猪的转基因上获得成功，在此基础上人们通过不断试验探索出其他的转基因技术，并且也在一些动物的转基因上获得成功。如逆转录病毒载体法、精子载体法、胚胎干细胞介导法等分别在牛、鸡、小鼠等动物的转基因上获得成功。但是，随着分子生物学的不断发展，研究人员对转基因结果的要求也越来越高，而这些传统的技术在一定程度上已不能满足人们的要求。为了得到更好、更符合人们意愿的试验结果，研究人员不断地探索着更为先进的转基因技术，锌指核酸酶（Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ，ＺＦＮ）技术就是一种新的转基因技术，由于其具有独特的剪切功能而引起了研究人员的极大兴趣。１９８６年Ｄｉａｋｕｎ等［２］首先在真核生物转录因子家族的ＤＮＡ结合区域发现了Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２锌指模块，到１９９６年Ｋｉｍ等［３］人工合成了第一个ＺＦＮ，再到Ｕｒｎｏｖ等［４］发现的由４个锌指连接而成的ＺＦＮ可识别２４ｂｐ的特异性序列，ＺＦＮ在转基因中的作用逐渐受到了研究人员的关注。 　　１动物转基因技术的常用方法 　　１．１逆转录病毒载体法 　　逆转录病毒载体法是利用病毒作为载体，将外源基因片段插入病毒载体的长末端重复序列的下游并通过其侵染作用将目的片段整合到宿主细胞的基因组中。该方法主要应用于转基因鸡和牛的生产。１９７４年Ｊａｎｅｎｉｓｃｈ等［５］发现注入小鼠囊胚腔中的ＳＶ４０ＤＮＡ能够在其体内发生整合。但真正用于转基因动物的则是Ｓａｌｔｅｒ等［６］研究人员，他们在１９８７年利用该方法生产出了转基因鸡；而Ｂｉｅｒｙ等［７］则在１９９５年以劳式肉瘤病毒（ＲＳＶ）为载体，通过将目的基因片段导入牛的胚胎，获得了转基因牛。此方法操作简便，整合效率高且整合的外源基因多为单拷贝，所以非常有利于对基因结构、功能及表达调控的研究［８］。 　　１．２精子载体法 　　精子载体法是通过将外源ＤＮＡ与精子混合培养后，利用带有外源ＤＮＡ的精子与卵细胞结合形成受精卵，然后将该受精卵通过胚胎移植转移到动物的子宫内，经过发育后形成转基因动物［９］。１９８９年Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等［１０］利用该方法生产出了转基因小鼠，并发现转基因小鼠体内的外源ＤＮＡ能够遗传给后代。他们的这一结果引起了其他研究人员的关注。该方法虽然操作简便，但其整合率低，需要通过改进来提高成功率。Ｓｑｕｉｒｅｓ等［１１］在该方法的基础上利用脂质体包埋外源ＤＮＡ的方法成功地获得了转基因鸡；Ａｎｔｈｏｎｙ等［１２］首先将精子的细胞膜破坏掉后再与外源ＤＮＡ混合培养，然后将带有外源ＤＮＡ的精子注入小鼠处于减数分裂中期的卵母细胞内，提高了转基因小鼠的数量。 　　１．３胚胎干细胞法 　　胚胎干细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＥＳ细胞）来源于早期的胚胎细胞，由于其具有高度未分化的特性，随着生命体的发育它可以分化为多种细胞类型［１３］。该方法主要是在体外通过同源重组的方法将外源ＤＮＡ片段整合到ＥＳ细胞的基因组中，然后再将ＥＳ细胞转移到动物的囊胚中，通过在动物体内的发育和分化，最终可以得到转基因的个体。ＥＳ细胞由于其具有未分化的特点，所以其在转基因动物研究中是研究人员非常青睐的一种受体细胞。但是ＥＳ细胞不能够从许多动物体内分离出来，当前只有在小鼠的研究中比较成功，所以对于其他动物来说还需要进行进一步的研究。 　　１．４体细胞核移植法 　　体细胞核移植法是将体细胞移入去核卵母细胞中，使其重组并能发育成新的胚胎，这个胚胎最终发育成动物个体。其过程为：①细胞核的采集和卵母细胞的准备；②细胞促融；③植入代孕母体。１９９７年英国ＰＰＬ公司罗斯林研究所首次利用这种方法获得克隆羊Ｄｏｌｌｙ。２年后，ＰＰＬ公司又利用这一技术获得２只定点整合的转基因羊。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等［１４］利用普通母羊的卵细胞与转基因获得的公羊的精子在体外人工受精后，将其细胞核转移到去核的胎儿成纤维细胞中，最终获得３只转基因奶山羊。目前，该方法已经在转基因羊、转基因鼠、转基因牛、转基因猪上获得成功。体细胞核移植法是将改造后的体细胞进行核移植，从而能够提高转基因的成功率。此外，该技术也可用于促进优良种群繁育，生产珍贵的医用蛋白，克隆动物的组织、器官移植的供体等，并且还可以对珍稀濒危动物进行克隆繁殖。１．５转座子介导法 　　转座子是一段能够在生物体的基因组中自主复制并移动的ＤＮＡ片段，在经过切割、重组等过程后可