室内药剂筛选试验.docVIP

　室内药剂筛选试验 1　含药培养基法 将牛肉膏蛋白胨培养基加热熔化, 待其冷却至40℃～ 45℃时, 分别加入各种药剂母液, 制成待测浓度的含药培养基, 充分摇匀后倒皿(培养皿直径为9cm )。然后用移液管在每皿已凝固的培养基中央分别加入各病菌的孢子悬浮液1.0m l, 以不加药剂的培养基为对照。每处理3 次重复, 于28℃恒温箱内培养, 用“十”字形测量法测量菌落直径 , 每天测量1 次, 连续测6 次,将末次的测量结果用于方差分析。 2　抑菌圈法 将牛肉膏蛋白胨培养基加热熔化, 冷却到45℃左右时, 将配制好的孢子悬浮液加入, 摇匀后倒皿。用打孔器将滤纸打成直径为0.15 cm 的圆碟, 灭菌后放入已配制好的药液中, 浸泡3min, 取出滴去多余的药液, 置于含菌培养基平板的中央, 每皿一片, 用灭菌纸碟浸无菌水作对照。于28℃恒温箱中培养, 每处理3 次重复, 用“十”字形测量法测量抑菌圈直径, 每天测1 次,连续测6 次, 将末次的测量结果用于方差分析。 3　孢子萌发法 分别按以上3种杀菌剂的使用浓度, 配制成含相应药剂浓度的孢子悬浮液, 然后涂于载玻片上, 置于相对湿度为100% + 水滴的保湿器中培养, 以灭菌水配制成的孢子悬浮液为对照, 每处理3 次重复, 培养6 h, 镜检孢子的萌发情况, 计算萌发率, 并进行方差分析 4、生长速率法 供试药剂分别用定量无菌水稀释成所需浓度,取1mL 稀释液放入灭菌培养皿(直径 = 90mm ) , 加9mL 培养基, 充分摇匀, 制成含不同药剂的培养基, 以加入等体积的无菌水的培养基平板为对照。培养基凝固后, 用打孔器(直径= 6mm ) 制取已活化的病菌菌饼, 菌丝面朝下接种于含药培养基中央,每处理3 次重复, 置于25℃恒温培养箱内黑暗培养, 3d 后交叉测量供试病菌在含不同药剂的培养基上的菌落直径, 与对照比较计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率, 分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。 室内毒力测定方法 采用菌丝生长速率法。在预备试验的基础上, 选择各药剂对病菌菌丝生长抑制率在10%～90%范围内的5个系列浓度; 将供试药剂分别用去离子水稀释成系列浓度, 按培养基与药液体积比9∶1的比例加入到已融化并冷却至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基中, 充分摇匀后迅速倒入灭菌的直径为9 cm培养皿中, 制成系列浓度的含药平板, 以加入等体积的无菌水的牛肉膏蛋白胨平板为对照。用直径为4 mm的打孔器截取在牛肉膏蛋白胨培养基上培养4 d 的病菌菌饼, 把菌饼反接到含药平板中央,每处理设3个重复, 置于25±1 ℃下培养96 h , 用十字交叉法测量菌落直径, 每个菌落按十字交叉法测量2次, 以其平均值代表菌落的大小, 计算抑制率。通过DPS分析软件求出药剂的毒力回归方程及EC50值。菌落扩展直径和药剂的抑制百分率计算公式如下。