枯草芽孢杆菌B111 中性蛋白酶基因BS2 在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(3):876-883 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.015 枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因 BS2 在毕赤酵母中的表达 白 玮，张 锐，郭三堆 （中国农业科学院生物技术研究所/ 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081 ） 摘要： 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源，纯化鉴定枯草芽孢杆菌 B111 分泌的抗棉花黄萎病菌蛋 白质，克隆其编码基因，并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶 QAE-A50 强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤，分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质 谱，鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列，构建表达载体 pPIC9K-PT，转化毕赤酵 母 GS115。转化子经 PCR 鉴定，甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴 定了一个来源于枯草芽孢杆菌 B111 的抗菌中性蛋白酶 BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因 BS2，并 在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD，表达水平29.77 mg·L-1 -1 ，水解酪素酶活力27 800 U·g ， 并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶 BS2，克隆其编码基 因BS2，并成功实现在酵母中的有效表达。 关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；抗菌活性；毕赤酵母表达 Cloning and Expression of a Neutral Protein Gene BS2 from Bacillus subtilis B111 in Pichia pastoris BAI Wei, ZHANG Rui, GUO San-dui (Biotechnology Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081 ) Abstract: 【Objective 】 In order to exploit novel disease-resistance gene and biological pesticide sources, antifungal protein secreted by Bacillus subtilis B111 was purified and identified, then its gene was cloned and expressed in Pichia pastoris. 【Method 】 Antifungal protein was purified by ultrafiltration, 90% ammonium sulfate precipitation and QAE Sephadex A50 ion exchange chromatogram column, then it was identified