去细胞同种异体神经种植雪旺细胞体外实验观察.pdfVIP

中文摘要 去细胞同种异体神经种植雪旺细胞的体外实验观察 摘 要 目的：雪旺细胞和基底膜管在周围神经损伤后的神经修 复性再生中起着非常重要的作用。雪旺细胞作为神经纤维内 主要的非神经元活性细胞，具有神经营养、趋化和使再生纤 维成熟等重要功能。基底膜管则能形成神经再生的支架性三 维空间从而起到接触引导的作用。 由于胎儿组织尚未具有明显的生物学特性，免疫系统处 于不成熟状态，对寄生环境有强烈依赖性，因此排斥反应发 生不明显，容易导致“免疫宽容”。胎龄为28天的胎兔周围 神经系统已经发育成熟。因此，采用胎兔周围神经培养雪旺 细胞，既避免了自体雪旺细胞来源受限及自体神经二次损伤 又可避免细胞移植后产生的免疫反应。已有的实验表明，最 近发展的化学萃取方法可有效清除神经中的雪旺细胞及髓 鞘，从而减轻异体神经的抗原性。而且，经过化学萃取的异 体神经在去除抗原成分的同时还可保留其完整的纤维支架 结构和完整的基底膜。去细胞技术的发展为临床寻找理想的 白体神经移植替代物开辟了新的途径。 本实验通过将胎兔雪旺细胞与经去细胞处理的同种异 体神经桥接体经体外结合培养，观察胎兔雪旺细胞在桥接体 中的生长情况并讨论将胎兔雪旺细胞植入去细胞同种异体 神经桥接体制备组织工程化人工神经修复周围神经缺损的 可7-7+P_-L。为含雪旺细胞的去细胞同种异体神经桥接复合体的 体内移植提供指导。 中文摘要 方法：1．细胞培养：取怀孕28天的新西兰白兔，耳缘静 脉注射空气处死后迅速取胎兔。在手术显微镜下无菌条件下 取胎兔坐骨神经，尽量剥除神经外膜及束膜。Hank’S液冲洗 培养雪旺细胞，培养过程中利用双差速贴壁法及Arab—C(终 末浓度1 (40ng／m1)促进SC生长。每日在倒置显微镜下观察细胞的 生长情况；2．去细胞神经桥接体制备：取成年健康新西兰白 兔一只，分别自梨状肌下缘水平以远切取双侧坐骨神经，作 为异体神经的来源。神经萃取前先在手术显微镜下去除表面 的脂肪组织及部分神经外膜，然后先置4。C蒸馏水中静置6h， 再将神经段放入3％TritonX一100中静置12h，然后置蒸馏水 对萃取的神经段行石蜡切片HE染色，Laminin(层粘连蛋白) 免疫组化染色及扫描电镜观察去细胞的情况；3．雪旺细胞的 植入：将培养好的原代SC以107／L的浓度用lOOul的微量注 射器注入去细胞神经段中央，注射后置于细胞培养液中继续 培养。分别与培养的1、3、5天通过石蜡切片HE染色观察 SC在桥接体中的生长情况。 结果：1．雪旺细胞培养与观察培养的雪旺细胞约于第 7天爬满6cm细胞培养皿，倒置显微镜下观察：雪旺细胞形 态为梭形，有突起，多为双极，偶见三个细胞突起。胞核明 显，核呈卵圆形。细胞呈端对端、肩并肩、旋涡状或栅栏样 排列生长。少量成纤维细胞呈“煎鸡蛋”样，胞体较雪旺细 胞大，扁平状，外形不规则，突起短而多，核仁明显，有2 到3个核仁。颜色较雪旺细胞浅；2．去细胞神经桥接体的 中文摘要 观察 一般性状观察：萃取后的神经呈乳白色，色暗，无光 泽，其外径及长度较新鲜神经减小，柔软，有韧性。HE染 色观察：Triton一100作用96小时后，神经纤维结构消失，红 染的神经内膜呈波浪状纵行排列，形成管柱状空隙。扫描电 镜下观察：神经内的轴突、髓鞘己被完全去除，可见由胶原 纤维构成的立体管状结构，部分管腔不规则。胶原纤维仍维 持原有的位置、形态及结构特征，管内可见膜样结构，为雪 旺细胞基底膜；3．重新细胞化的去细胞神经桥接复合体的 观察细胞注射后1天神经桥接复合物HE染色可见细胞在桥 接体内成团分布，排列不规则：3天后分散，5天后排列较规 则。 结论：采用双差速贴壁法去除绝大部分成纤维细胞后在 细胞培养的初期使用Arab—C抑制成纤维细胞生长，后期培 养液中加入NGF促进雪旺细胞生长能获取大量雪旺细胞且 纯度可达90％以上。用3％TritonX一100作用96h可去除周 围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维 支架结构，并且对神经基底膜主要成分一层粘连蛋白无明显 影响。采用胎兔坐骨神经培养的雪旺细胞能在用成年兔坐骨 神经制备的去细胞桥神经接体中生长良好，并且有迁移成行 的特性。种植胎儿雪旺细胞重新细胞化的去细胞同种异体神 经将可能成为