Taqman-MGB探针荧光定量PCR方法检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的研究.pdfVIP

第32卷第1期 应用海洋学学报 V01．32．No．1 2013年2月 JOurnalOfApp¨edOceanography Feb．．2013 man—MG Taq B探针荧光定量PCR方法检测对虾 传染性皮下及造血组织坏死病毒的研究 徐丽美，李福英 (国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建厦门361005) 用Taqman—MGB荧光定量PCR方法，设计了一组特异性引物和探针．利用阳性标准模板进行了定 量PCR条件的优化研究．结果显示，在101～108拷贝范围内标准曲线的线性关系为R=0．9994，检 测灵敏度达到10拷贝，重复检测的变异系数均小于2％．利用上述建立的方法和条件，测定39份 不同来源的对虾样品中IHHNV，检出率为49％．因此所建立的荧光定量PCR具有较高的灵敏度、 特异性和重复性，可作为IHHNV快速的定量检测方法． DOI：10．3969／J．ISSN2013．01．018 中图分类号：P735 文献标识码：B 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(infec— 染料法的缺点是不能区分特异性PcR产物和引物 tious and necrosis hypoderⅡIalhematopoieticvinls，IH—二聚体等非特异产物，因此干扰结果的判断．而探针 HNV)是已知对虾病毒中最小的病毒，为线性单链法以其引物和探针的双重特异性，使得方法的特异 DNA病毒，基因组长度为4．1 kb，隶属于细小病毒 科(Parvoviridae)一1．该病毒于1981年在美国夏威光性淬灭基团，同时探针3’端连接了MGB，使Tm值 夷地区养殖细角滨对虾(￡ifope肥eMss￡yfiros￡ris)中首提高，探针长度缩短，荧光背景降低，信噪比更高．且 次被发现，能感染野生和养殖对虾，对细角滨对虾有 qPCR反应产物无需电泳，污染的可能性减少，因此 较高致病性和死亡率2{，对凡纳滨对虾(腑opmoew 抛虺眦m州可导致慢性矮小残缺综合症(mnt—deform— 高、特异性好，准确无污染而成为病原定量检测的首 诜[4引． itysyndrome，RDs)¨。．而凡纳滨对虾由于其生长快， 盐度适用范围广，抗病力强等优点，已成为我国对虾 1材料与方法 养殖的主要品种；但又作为易感种群，感染病毒后， 1．1 主要仪器和试剂 即使不致死却由于生长缓慢、产品规格参差不齐， 荧光定量PcR仪型号为Roto卜gene6000(co． 同样也给养殖业造成极大的经济损失，因此建立 bett 一种快速、灵敏、特异、准确的定量检测方法，对于 Realtime PCRMaster 健康苗种筛选以及养殖过程中病毒的监测是必不 Mix(TOYOB0公司)． 1。2 弓I物和探针 可少的． 引物和探针序列根据IHHNV基因组序列 荧光定量PcR(qPcR)技术是指在PcR反应体 系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测PcR反 应的整个进程，最