现代生物技术在环境微生物学中的应用__聚合酶链反应.pdfVIP

氨基酸和生物资源 Amino Acids Biotic Resources 2003 ,25 ( 1) :47～50 ·47 · 现代生物技术在环境微生物学中的应用 : Ⅱ. 聚合酶链反应 张 　婷 ,倪丽娜 ,安志东 (武汉大学生命科学学院 ,武汉 430072) 摘要 :这是现代生物技术在环境微生物学中的应用系列综述文章的第二篇 ,讨论聚合酶链反应 。这篇文章包含 PCR 步 骤 ,特异基因的 PCR 检出 ,逆转录酶 PCR ,综合细胞培养 PCR ,多重 PCR 和半嵌套式 PCR 和 PCR 指纹法 。 关键词 :现代生物技术 ;环境微生物学 ;聚合酶链反应 ( ) 中图分类号 :Q9306 　　　　　　　文献标识码 :A 　　　　　　　文章编号 :1006 - 8376 2003 01 - 0047 - 04 1 　聚合酶链反应 1. 1 　PCR 步骤 ( ) 聚合酶链反应 PCR 是一项能把靶 DNA 量扩 一个典型的 PCR 循环有三个步骤 。第一步须包括 增百万倍或更多的技术 ,它彻底改革了分子生物学 dsDNA 变性成两条单链的靶 DNA 或模板 DNA ( ssD 的方法学 。PCR 在 1985 年首次被发现 ,现在已成为 NA) 。加到反应混合物 中的有两种不 同的短单链 包括与环境微生物学相关的实验室在内的许多生物 DNA ,称为引物 ,这些引物是经过认真选择的市售的 学实验室的重要实验方法 。可以扩增环境中少量的 合成商品。在特异 PCR 反应 , 例如任意引物 PCR DNA 这一能力使检出非常灵敏 。例如 ,用传统的培 (AP - PCR) 中 ,只加入单一的引物 。引物是与靶 ss 养技术检出 1 克土壤中的 100 个沙门氏菌细胞会非 DNA 模板互补的寡核苷酸序列 ,所以能与靶 ssDNA 常困难 ,然而把 100 个细胞扩增成百万细胞使检出 杂交或退火 , 同时也限定了扩增区域 。一个引物是 容易得多 。PCR 是一种相当简单的酶促反应 ,它用 上游引物 ,而另一个是下游引物 。这样就简明地规 一种 DNA 聚合酶复制靶 DNA 序列重复25 —30 个循 定了引物与 ssDNA 模板退火的位置 。PCR 循环的第 环 。在 PCR 的每一个循环中 ,靶 DNA 的量都加倍 , 二步是引物退火 ,这一步是引物与适当的靶序列杂 导致 DNA 量指数增加 。理论上 ,25 个循环可扩增 交 。第三步也是最后一步是延伸 。在这一步 ,一种 到 225 ,但在实践中 ,我们得到大约百万倍的靶序列 。 DNA 聚合酶通过把适当的碱基加到已与靶 DNA 杂 这是因为扩增效率还不十分完美 。PCR 产物往往用 交的引物上来合成原始 ssDNA 的互补链 。一个循 琼脂糖凝胶电泳来显示 ,其大小通过与已知大小的 环的净产物是与原始双链 DNA 分子等同的两个双