DNA提取及PCR扩增实验报告.docVIP

PCR扩增DNA琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的．学习并掌握PCR的基本原理与实验技术。 ．。二、实验原理 . PCR扩增 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA四种脱氧核苷酸（dNTP）耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（5℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按方式扩增。经过～个循环，DNA。 . DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器：移液枪、。试剂： TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、引物、无菌ddH2O、模板DNA TBE、 实验步骤. PCR扩增无菌ddH2O 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下： 预变性： 94℃ min 循环： 94℃ 变性30s 5℃ 退火30s 72℃ 延伸30s 末次延伸：72℃ 5min℃环境中。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的。 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。 待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。 在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。五、实验结果与讨论 如图所示：前8列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker对比可知该片段出现在100bp左右，并非由于实验操作等问题而产生的污染。 实验的照片显示实验结果有拖尾现象，但是并不影响后续实验。在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，并没有完全加入，可能会出现一些误差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。 六、实验注意事项 由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。 4.EB具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。 七、通过本次实验学习并掌握了PCR反应的基本原理实验技术。 通过本次实验掌握了电泳实验分离DNA的原理和方法。八、思考题 1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？通过PCR扩增出想要的片段，电泳回收，与合适的载体连接，转化进感受态细胞培养提质粒，酶切或PCR验证，测序最终验证，保存菌种一对引物序列为5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和5‘-AACCGTGGCGACACCGC