型胶原蛋白抗血清的制备和检测.docVIP

Ⅱ型胶原蛋白抗血清的制备和检测【摘要】? 目的： 探讨型胶原蛋白（collagen protein type , CⅡ)抗体产生规律，制备C抗血清。方法： 采用纯化的鸡和猪C免疫新西兰白兔，每隔10 d收集血清，以改良间接ELISA法检测抗C抗体效价。结果： 鸡C免疫新西兰白兔后，第10天抗体效价为13 200，第20天升至1204 800；加强免疫后，第30天和第40天抗体效价分别达到1409 600和1819 200。猪C免疫新西兰白兔后，第10天血清中未能检测出抗体，第20天血清抗体效价为13 200；加强免疫后，第30天和第40天抗体效价分别为151 200和1102 400。结论： 采用纯化的鸡和猪C免疫新西兰白兔后，经一定潜伏期血清中出现抗体，可以获得高效价抗C抗体血清。抗体产生情况符合机体初次及再次免疫应答的有关规律，但血清抗体产生的潜伏期和效价与不同种属来源的胶原蛋白有关。 【关键词】? 鸡； 猪； 型胶原蛋白； 抗型胶原蛋白抗体； 酶联免疫吸附实验 近年来研究表明，类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发病与型胶原蛋白(collagen protein type, CⅡ)自身免疫反应有关［1，2］，在RA患者血清和关节部位可检测到抗C抗体［3］，用C免疫动物可产生胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA），将抗C抗体给动物输注亦可产生或有助于产生关节炎［4］，因此C及其自身抗体对RA的发病起着非常重要的作用，但其作用机制和致病机制仍不清楚。不同动物来源的C可作为抗原免疫异种动物，不仅能得到相应的抗体，而且有助于了解C和抗C抗体在RA等疾病中的发病机制。我们采用纯化的鸡和猪C免疫新西兰白兔，每隔一定时间收集血清，以ELISA法检测抗C抗体效价，获得了高效价的型胶原抗血清，同时对鸡和猪C抗体产生规律进行了比较和分析。 　　1? 材料与方法 　　1.1? 主要试剂? ??? 　　胃蛋白酶（Amersco分装，武汉博士德生物工程有限公司）；鸡型胶原蛋白参照品（C9301，Sigma公司）；29～205 KD蛋白质相对分子质量标志物（上海华舜生物工程有限公司）；HRP羊抗兔IgG（SA0040，上海普飞生物技术有限公司）；四甲基联苯胺（TMB，上海华美生物工程公司）；弗氏佐剂（Sigma公司）。其余均为分析纯试剂。 　　1.2? 主要仪器? ??? 　　电泳仪（Bio-Rad公司）；Gene Genius全自动图像分析系统（澳大利亚）；Super T21冷冻离心机（美国）；μQuant紫外可见扫描酶标仪（美国，Bio-Tek仪器公司）。 　　1.3? 免疫用动物? ??? 　　新西兰白兔6只，雄性，体质量2.0～2.4 kg，购自南京江宁种兔厂。分为两组，每组3只，分别用于鸡型胶原蛋白和猪型胶原蛋白的免疫。 　　1.4? 型胶原蛋白的提取、纯化和鉴定? ??? 　　以鸡胸剑突软骨和猪关节透明软骨为原料，用盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析等步骤提取与纯化鸡型胶原蛋白和猪型胶原蛋白。具体方法参照文献［5，6］进行。 　　1.5? 兔抗型胶原蛋白抗血清的制备与标本采集? ??? 　　将2 mg/ml精制无菌型胶原蛋白与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，于新西兰大白兔的背部皮下进行多点注射，每只3 mg 型胶原蛋白。于第20天追加抗原刺激，每只腹腔注射胶原蛋白2 mg。免疫前和免疫后每隔10 d，耳静脉采血，分离血清，-20冻存。 　　1.6? 血清抗型胶原蛋白抗体的检测? ??? 　　参照Fujii等［7］的ELISA法，优化实验条件，建立抗型胶原蛋白抗体间接ELISA法。将新鲜羊血清60 20 min灭活，加入适量Tris（终浓度0.05 mol/L）和NaCl（终浓度0.15 mol/L），用2 mol/L HCl调pH至8.0备用。用pH7.6的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液将C配成20 μg／ml，4 12 h进行包被，继以10%羊血清，37 2 h进行封闭；待测血清用含10%羊血清的缓冲液血清作150稀释，37 2 h后洗3次；用含10%羊血清的缓冲液将羊抗兔酶标IgG抗体作11000稀释，37 1 h后洗3次；显色底物为TMB-H2O2，以2 mol/L? H2SO4终止反应。检测波长为450 nm/630 nm；以测定孔D值与阴性对照平均D值的比值大于2.1者为阳性。 　　1.7? 血清抗型胶原蛋白抗体效价的检测? ??? 　　将ELISA法检测为阳性的血清作系列稀释，采用上述间接ELISA法测定，以呈阳性的最高稀释倍数作为血清型胶原蛋白抗体效价。 　　2? 结果 　　2.1? 型胶原蛋白纯度鉴定? ???　　从鸡