刺猬蛋白促进内耳Math1表达的实验研究_临床医学论文.docVIP

刺猬蛋白促进内耳Math1表达的实验研究_临床医学论文 刺猬蛋白促进内耳Math1表达的实验研究_临床医学论文 作者：胡晓华， 黄建民， 林国经 【摘要】 　　目的 研究刺猬蛋白(Shh)对体外小鼠耳蜗多潜能祖代细胞(CNPs)的Math1的调节作用，探讨治疗感音神经性耳聋的新方法。 方法 体外分离培养出生后第1天小鼠的CNPs细胞，在DMEM/F12+Shh培养基培养，用RT、荧光素酶检测系统、免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪等方法检测诱导CNPs细胞早期分化的重要转录因子Math1的表达。 结果 Shh诱导分化组的Math1 mRNA表达、Math1启动子的转录水平及Math1蛋白表达阳性率均高于未诱导细胞(0.05);抑制剂LY294002具有显著下调Shh对Math1启动子转录水平和Math1蛋白表达的作用(0.05)。 结论 出生后第1天小鼠的CNPs细胞能够在Shh的诱导下，促进Math1的转录和表达，诱导耳蜗毛细胞的早期分化。 【关键词】 耳蜗 基因表达 毛细胞 反式激活因子类 听觉丧失 感音神经性 逆转录聚合酶链反应 　　大多数的感音神经性耳聋是由毛细胞和与之相联系的螺旋神经的损伤和退化所造成。耳蜗祖毛细胞存在于哺乳动物的耳蜗，并且有取代缺失的听毛细胞的潜能，但这些细胞处于静止状态，并不会自发增生或分化为毛细胞[1。目前尚未发现哺乳类动物内耳毛细胞自发再生的现象。虽然迄今国内外已进行了许多研究，但尚未发现促使内耳毛细胞再生的有效方法。本研究通过体外诱导小鼠耳蜗多潜能祖代细胞(cochlear neural progenitors,CNPs)的Math1的表达，探讨刺猬蛋白(sonic hedgehog，Shh)对耳蜗毛细胞早期分化的作用，为感音神经性耳聋治疗提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 CNPs细胞的分离培养、诱导 出生后第1天的小鼠(C57BJ/6，美国明尼苏达州大学)，颈椎脱臼法处死，在显微镜下精确分离出耳蜗组织，从耳蜗组织内分离出耳蜗细胞，使用DMEM/F12+1%N2+EGF(10 ng/mL)+bFGF(10 ng/mL)培养基，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养，发现细胞传代良好，并行细胞克隆分析，挑选单细胞克隆。取第45～55代形态较好的细胞，用DMEM/F12培养基洗涤，实验组加入DMEM/F12+Shh培养液，对照组加入DMEM/F12+PBS培养液，正常细胞形态也作为一种对照，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养1 d，每天换液，倒置显微镜(日本Zeiss公司)下观察细胞形态及生长情况。 　　1.2 CNPs细胞Math1、myosinVIIa、p27kip1、S100a、Ν3、MAP2的mRNA表达水平测定 提取实验组、对照组及正常CNPs细胞的mRNA，进行mRNA浓度、纯度、完整性检验，按一定的方法转换为cDNA，后进行PCR扩增。引物由美国Integrated DNA Technologies公司合成。 　　内参GAPDH(441 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　Math1(452 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　myosinVIIa(628 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　p27kip1(524 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　S100a(500 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　β3： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　MAP2(535 bp)： 　　上游：5’ 　　下游：5’ 　　扩增条件：94 ℃ 10 min→94 ℃ 30 s→退火温度 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 5 min。Math1、myosin VIIa、p27kip1、S100a、β3、MAP2及GAPDH的退火温度分别为58.5、65、66、63、59、62.5及61 ℃。GAPDH系管家基因，是小鼠细胞内普遍稳定表达、表达量较恒定的基因，因此作为内源性基因模板标准。 　　取PCR产物，加入SYBR GREEN和蓝色染料混匀后经2%琼脂糖凝胶中电泳分离，同时2%琼脂糖凝胶中加入DNA ladder电泳，DNA ladder起标示电泳条带位置作用，将电泳后的琼脂糖凝胶在电泳显像仪分析、摄像。 　　1.3 荧光素酶检测系统检测Shh对Math1启动子的表达作用 将CNPs细胞放于12孔细胞培养板，24 h当细胞密度达到60%，使用lipofectin(终浓度6 μg/mL)同时转染Math1启动子(终浓度1.4 μg/mL)和β终浓度0.7 μg/mL)，16 h后，含4%胎牛血清的培养液恢复24 h，DMEM/F12洗涤后，实验组加入DMEM/F12+