原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较_临床医学论文.docVIP

原核表达的含PTD不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较_临床医学论文 原核表达的含PTD不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较_临床医学论文 作者：田雨香 许逊 蔺昕 陈勋 宗扬勇 招倩倩 季宝菊 王胜军 许化溪 邵启祥 【摘要】 　　目的： 评价HIV蛋白转导结构域(PTD)携带的不同分子质量融合蛋白的穿细胞膜能力。方法： 诱导表达、纯化含PTD的不同分子质量的融合蛋白，与细胞共育后，通过流式细胞术、激光共聚焦评价融合蛋白穿膜能力。结果： 诱导表达、纯化获得3种含PTD的不同分子质量的融合蛋白。流式细胞术和激光共聚焦方法分析发现3种融合蛋白均具有高效穿膜能力。结论： PTD介导融合蛋白的穿膜能力与分子质量无直接关系。 【关键词】 蛋白转导结构域； 穿膜效率； 增强型绿色荧光蛋白； 分子质量 　　［Abstract］Objective: To judge the efficacy of the fusion protein including protein transduction domain of HIV TAT by multiular uptake protein for the further research of its biofunction.Methods： The expression of three fusion proteins were induced by IPTG and were purified from the inclusion bodies. Flow cytometry analysis and confocal microscope observation were used to evaluate the efficacy of the fusion proteins to transduce into the Jurkat cells, when the cells were exposed to fusion protein. Results： The fusion proteins could transduce into Jurkat T cells efficiently. Conclusion： All the three fusion proteins could cross the cell membrane and had no difference. 　　［Key words］protein transduction domain; the efficacy of transmembrane; prokaryotic expression； green fluorescence protein 　　1988年Green和Frankel分别发现HIV蛋白能够穿过细胞膜［1,2］，随后的研究发现，TAT蛋白中的47～57(YGRKKRRQRRR) 位氨基酸才是真正具有转导作用的区域，被称为蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)［3］。该区域能转导自身及与其融合的多肽、蛋白及DNA分子进入几乎所有组织和细胞，甚至血脑脊液屏障，转导效率高且对细胞无明显的损伤［4-6］。PTD的发现，在研究蛋白功能和治疗方面有重要作用。绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)相对分子质量为27 ku，在395 nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光［7］，它的表达没有种属特异性，而且产生的荧光不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之动物体内不产生内源性GFP，因此成为活细胞理想的标记物［8］。增强型绿色荧光蛋白(eGFP) 是GFP的突变体，在480 nm波长的激发光下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光［9］，作为报告蛋白，已经广泛应用于基础实验研究。我们利用本实验室现有的PTD载体，构建同一个目的蛋白的全长和其不同结构域（即片段1和片段2）的表达质粒，在大肠埃希菌中表达，得到3种纯化的蛋白，研究PTDGFP携带的3种不同分子质量融合蛋白的穿膜效率和能力。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　pET28a目的蛋白，pET28a片段1，pET28a片段2载体由我室构建［10］；工程菌E.Coli DH5α，Rosetta和Jurkat为本实验组保存。纯化树脂Profinity Ni2+金属螯合填料（美国Bio公司 ），蛋白标准参照购自Fermentas公司，鼠抗单克隆抗体(Cell Signaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒、PD10脱盐