口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达_临床医学论文.docVIP

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达_临床医学论文 口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达_临床医学论文 作者：李杰, 王若, 石玮, 边海霞, 张丽, 张雷, 王家鑫 【摘要】 目的: 构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC)。方法: 将pMD克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达。结果: 构建的pcDNA3.1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1。结论: 成功地构建了重组质粒pcDNA3.1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达。 【关键词】 口蹄疫病毒; VP1基因; 真核表达; 细胞转染; 树突状细胞 　　[Abstract] AIM: To construct the eukaryotic expression vectors for the FMDV VP1 gene and transfect dendritic cells(DC) for the expression of VP1. METHODS: The plasmid pMDs were transfected into DC by lipofectamine method and the positive cell clones were screened with G418. The expression of FMDV VP1 gene in DC was determined by Western blot. RESULTS: The correct construction of pcDNA3.1VP1 was identified by means of restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination. It was showed by SDSPAGE and Western blot that transfected cells, DC, expressed FMDV VP1 gene constantly. CONCLUSION: The pcDNA3.1VP1 eukaryotic expression plasmids are successfully constructed and VP1 gene can be sustainly expressed in DC. 　　[Keywords]foot 口蹄疫病毒(foot分为O、 A、 C、 Asia I、 SAT1、 SAT2和SAT3等7个血清型。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4各60分子组成, 其中VP1为主要的抗原蛋白, 在已发现的O型5个抗原位点中有3个位于VP1上。在VP1第140～160位氨基酸处有一个长的、 结构稳定的G环, 环上的氨基酸构成能刺激免疫应答的T、 B细胞抗原表位, 是病毒表面的主要抗原位点, 在其顶部形成一个高度保守的Arg序列, 是FMDV与宿主细胞受体相结合的位点[1, 2]。VP1是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的最重要的结构蛋白, 它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面, 在免疫应答中发挥着主要作用[3]。因此, VP1成为各类新型疫苗研究的主要抗原之一。DC是目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞, 并能以交叉途径提呈非复制性抗原, 激活CD8+T细胞, 从而发挥对病原体的杀伤作用[4]。基因转染的DC可以激活CD8+T细胞产生IFN并诱导CD4+T细胞产生更多的Th1型细胞因子, 因此, 基于DC的基因工程研究已成为抗病毒免疫的一个热点问题[6]。有报道显示, DC在机体抗FMDV感染免疫中发挥重要作用[7], 但野毒感染可造成DC功能严重损伤。同时, 由于对FMDV的灭活处理可直接改变病毒蛋白的抗原性质, 所以用灭活FMDV作为抗原来源研究DC提呈抗原的机制则不能反映机体的自然过程。因此, 将FMDV的VP1基因转染DC, 使其表达VP1就成为研究DC提呈FMDV抗原机制的理想途径之一。本研究中, 我们构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达质粒pcDNA3.1利用脂质体转染DC, 得到了稳定表达。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 O型FMDV的pMD质粒由军事兽医学研究所金宁一教授惠赠, 大肠杆菌