四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析_临床医学论文.docVIP

四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析_临床医学论文 四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析_临床医学论文 作者：骆耐香 陈森洲 徐雅娟 【摘要】 　　目的 利用基因工程技术构建含人源抗癌胚抗原(CEA)单链抗体(scFv)的4种嵌合免疫受体（CIR），比较其在T淋巴细胞表面表达的情况。方法 将构建好的嵌合免疫受体CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3通过电穿孔方法分别转染人T淋巴细胞，流式细胞仪检测各嵌合免疫受体在T淋巴细胞的表达情况。结果 有3种嵌合免疫受体成功表达在T细胞的表面，它们分别是CIR1、CIR2、CIR3，其中CIR3的表达更好。结论 嵌合免疫受体能够在T淋巴细胞的表面有效表达，为下一步的体内实验打下基础，同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。 【关键词】 嵌合免疫受体；癌胚抗原；电穿孔转染；流式细胞术；人T淋巴细胞 【Abstract】 Objective To compare the expressions of four chimeric immune receptors (CIRs) with antiocyte via electroporation in vitro. Methods Four CIRs (CIRZ, CIR1, CIR2, CIR3) with antiCEAscFv gene were transfected into human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy adults respectively. The expressions of surface molecules of CIRs were detected by flow cytometry after 16hour transfection.Results Flow cytometry showed that CIR1, CIR2, CIR3 genes were efficiently expressed after transfection. But CIRZ cannot be detected any expression. Conclusions Three kinds of CIR genes can successfully express on human T lymphocytes surface. It can be the foundation of the further study and can provide the reliable evidence for clinical using this therapy. 【Key words】 Chimeric immune receptor; Carcinoembryonic antigen; Electroporation; Flow cytometry; Human T lymphocyte 　　大多数肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原，由于胸腺的选择机制和耐受机制，机体针对这些抗原产生的T淋巴细胞中大多数T细胞受体（TCR）的亲和力都比较低，从而限制了其肿瘤识别及杀伤效果。将克隆的高亲和力识别TAA的T淋巴细胞受体也称嵌合免疫受体（CIR）通过基因转染技术转染给T淋巴细胞，可以使重定向的原来无肿瘤识别能力的T细胞在体外和体内有效识别并杀伤肿瘤细胞〔1〕。近年来利用基因工程技术构建的T淋巴细胞嵌合免疫受体，它包括识别TAA的单链抗体（scFv）和T淋巴细胞的活化基序，通过真核细胞表达载体转染T淋巴细胞，使T淋巴细胞能识别并杀伤肿瘤细胞。我们将含人源化抗癌胚抗原(CEA)scFv的4种CIR，即CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3，转染人T淋巴细胞后检测其在人T淋巴细胞的表达，筛选出高表达的CIR，为进一步进行体内实验提供基础，同时为这一治疗策略最终应用于临床提供可靠的实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要仪器和材料 　　电穿孔仪NucleofectorTM为Amaxa Biosystems公司产品，流式细胞仪FACS Calibur为美国BD Biosciences公司产品。培养基AIM购自Sigma公司。健康人外周血由福冈红十字血液中心提供。CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3为本研究室制备，见图1。别藻兰蛋白(APC)标记试剂盒购自日本Dojindo分子技术有限公司，按说明将其标记CEA。 　　1.2 细胞分离与培养 　　按常规方法分离淋巴细胞。将分离的人T淋巴细胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的AIM培养基中，37℃含5% CO2的细胞培养箱中培养，