垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探_临床医学论文.docVIP

垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探_临床医学论文 垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探_临床医学论文 【摘要】 目的： 观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞HepG2生长及其肿瘤相关分子指标的影响。方法： MTT法测定CCW对 HepG2细胞增殖的作用;流式细胞术观察细胞周期的改变;分别用RT及免疫细胞化学法检测CCW对VEGF、c基因及蛋白水平的影响。结果： HepG2细胞的增殖在CCW作用的第24、48和72 h均被显著地抑制;CCW(100、200 μg·ml-1)可使HepG2细胞阻滞于G0/G1期;CCW可显著下调VEGF、c的mRNA及蛋白水平的表达。结论： CCW对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用，并且能阻止细胞进入G2/M期，这可能与c基因表达的下调密切相关;CCW能抑制HepG2细胞的VEGF分泌，初步推测CCW具有抗血管生成作用。 【关键词】 垂盆草; 肝癌; 抗增殖; 细胞周期; 抗血管生成 垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)又称卧茎景天，系景天科多年生草本植物，分布于全国大部分地区。垂盆草主要含有垂盆草苷类、黄酮类、三萜类、甾醇、生物碱及糖类。此药性凉，味甘、淡，新鲜或干燥全草入药，主要用于治疗湿热黄疽、小便不利、痈肿疮疡，并且具有抑制炎性渗出，减少肝细胞损伤，降低血清丙基酸氨基转移酶水平，治疗急、慢性肝炎等功效[1]。近年来，国内外大量研究表明，慢性病毒性肝炎与肝癌(hepatocellular carcinoma)的发生有着密切的联系[2，一些传统中草药中的黄酮、生物碱及多糖等成分在抗肿瘤、延长患者生命等方面有着独特的生物活性，不仅能够抑制肿瘤细胞增殖，还能有效抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和原癌基因c的表达[4，而VEGF和c在肝癌的形成、生长、浸润、转移过程中均发挥着重要的作用[8]。因此，本研究着重观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞 HepG2生长及肿瘤相关基因VEGF和c表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　垂盆草购于江苏省药材公司。MTT、蛋白酶(Sigma公司)，RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Biozol RNA提取剂(BioFlux公司)，MMLV 酶、Taq DNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、c和β引物由Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.(上海)合成，兔抗人VEGF、c抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒、DAB检验试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱MCO公司)，真空冷冻干燥机(Matin Christ公司)，酶标仪(Bio公司)，PTC仪(Bio公司)，Gel Doc EQ图像分析仪(Bio公司)，FACS Calibur 流式细胞仪 (Becton公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 垂盆草醇提物的制备 垂盆草干草500 g，于95%的乙醇5 000 ml中浸泡5 d，纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离心取上清，所得上清液经减压蒸发挥去溶剂，再用石油醚经索氏提取法去除脂类，挥去石油醚,再用甲醇溶解，减压蒸干得醇提物。 　　1.2.2 细胞培养 人肝癌细胞 HepG2于含10%小牛血清、青霉素100 U·ml-1、链霉素150 μg·ml-1的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。 　　1.2.3 细胞增殖能力的检测 将肿瘤细胞培养至对数生长期，计数，调整细胞浓度为1×105ml-1，接种于96孔板，80 μl·孔-1，3 h贴壁后加入终质量浓度分别为 25、50、100、200 μg·ml-1的CCW，同时设0. 1 %DMSO对照组，每组设6个平行孔，将培养板置5%CO2、37 ℃培养箱中培养24、48、72 h后MTT法检测[9]。 　　1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期细胞调成浓度为2×105 ml-1，300 μl·孔-1接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加入质量浓度分别为50、100、200 μg·ml-1的CCW，对照组加含0.1%DMSO的同体积培养液，设4个复孔。分别收集对照组和醇提物各剂量作用48 h后的HepG2细胞1×106个，70 %乙醇4 ℃固定过夜，PBS清洗，加入含2 %Triton、50 μg·ml-1 RNase A的PI溶液，4 ℃避光染色30 min, 上机检测2×104个细胞，用WinMDI分析软件分析结果。 　　1.2.5 RT检测肝癌细胞的VEGF和c的mRNA水平