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基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究_临床医学论文 基于可视化蛋白芯片的抗体分析方法研究_临床医学论文 作者：于辙, 刘志红, 吴英松, 高建恩, 孙启鸿, 李明, 印莉萍, 许丹科 【摘要】 　　目的: 建立一种基于蛋白芯片技术的抗体分析新方法。方法: 将待分析的抗体制备成抗体芯片, 并与生物素标记的抗原反应, 然后经银增强法显色, 获得可直接观察的微阵列芯片可视化反应结果。结果: 实验中分析了10种18株抗体的活性和特异性的强弱, 其中6株抗体具有较强的特异性。其中, ⅢC013、 HPSⅡB007、 HPSⅢB007分别对球蛋白和白蛋白的最低检测浓度可达0.4 μg/L。结论: 该方法具有通量化前景, 且具有微量化、 操作简便快捷和结果可视化等特点。 【关键词】 抗体芯片 银增强显色法 抗体检测 　　[Abstract] AIM: To establish a novel method for antibody analysis based on visual protein microarray. METHODS: The antibodies spotted on the aldehyded with corresponding antigens labeled by biotin, followed by silver enhancement detection method, and the chromogenic images were scanned by CCD camera. RESULTS: The affinity and specificity of each antibody was assayed by this method and six antibodies were found to have higher specificity than the others. A detection limit of 0.4 μg/L was obtained for antiglobulinⅢC013, antialbumin HPSⅡB007, and antialbumin HPSⅢB007. CONCLUSION: This method is simple, fast and visual. In addition, it needs less sample amount than traditional immunoassay and has potential to achieve high throughput. 　　[Keywords]antibody array; silver enhancement detection; antibody assay 　　抗体是蛋白质研究的重要工具之一, 目前在抗体筛选中主要是依赖于传统的ELISA方法[1-3]。近年来, 在抗体筛选过程中已有引入蛋白芯片技术的报道, de Wildt等[4]用带有抗体基因的高密度细菌阵列筛选重组抗体, 何为等[5]制备抗体芯片筛选不同株的抗白蛋白、 抗球蛋白, De Masi[6]和Love[7]等在高通量的单克隆抗体（mAb）制备与筛选中引进了通量化的抗原芯片系统, 进行克隆抗体的筛选。 　　本研究中采用蛋白芯片技术并结合银增强检测方法, 初步建立了基于抗体芯片技术的抗体活性和特异性的可视化分析, 实验对10种18株抗体的活性和特异性强弱及检测限作了相应研究, 获得了初步满意的结果。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 八针手动芯片点样仪(VP478, 美国Vamp;P Scientific公司), CCD芯片扫描仪（美国Photometrix公司）, 微量透析器、 透析器用超滤膜（1 kD）（美国Sigma公司）, GenePixTM Pro3.0芯片图象分析软件,醛基化玻片(美国CEL Associates公司), 牛血清白蛋白（BSA）、 生物素琥珀酰亚胺酯、 胶体金标记链亲和素、 银增强试剂A、 B(美国Sigma公司), 鼠IgG（华美生物工程公司）, 10种抗原及18株抗体为南方医科大学生物技术学院和北京蛋白质组研究中心抗体工程实验室提供, 其他试剂为国产分析纯试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标记抗原 抗原用PBS(pH7.4)稀释成0.5 g/L, 再与10 g/L生物素琥珀酰亚胺酯室温条件下作用4 h, 1 mol/L NH4Cl终止反应, 将反应液加入微量透析器, PBS(pH7.4)缓冲液中透析过夜, 得到的溶液-20℃条件下保存。 　　1.2.2 抗体芯片制备 小型八针手动点样仪将抗体点到醛基化玻片, 通过抗体上的氨基与玻片表面的醛基反应实现样品的固定。将待测抗