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固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中的生长素_临床医学论文 固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中的生长素_临床医学论文 作者：符继红 褚金芳 王吉德 闫存玉 【摘要】 建立了固相萃取反相高效液相色谱荧光检测法测定拟南芥中生长素的方法。采用Waters sunfire C18(150 mm×4.6mm,5μm)色谱柱，以乙腈乙酸钠(20∶80， V/V，乙酸调节至pH 3.5)为流动相，在流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温20 ℃，样品温度10 ℃，荧光激发和发射波长分别为275和345 nm条件下，分离测定了拟南芥中的植物生长素吲哚乙酸和吲哚丙酸含量。分离效果良好，线性范围分别为85.71 pg～21.43 ng和0.33 ng～1.29μg,相关系数分别为0.9992和0.9999，相对标准偏差小于5%，平均回收率分别为103.8%和102.6%。本方法可对少量模式植物样品进行灵敏、准确的定量分析。 【关键词】 固相萃取，生长素，吲哚乙酸，吲哚丙酸，拟南芥，高效液相色谱 　1 引 言 　　植物激素是在植物体内某一部位合成，并可转移到其它部位，调节植物生长发育具有显著的微量有机物。植物激素在植物生长发育过程中发挥着重要作用[1]。植物功能基因对植物生长发育起到的精细调控作用通常以植物激素的形式体现出来,植物激素含量的微小变化就能够引起植物明显的生理变化，对其进行提取和测定非常困难。生长素是最早发现的一种植物激素，主要功能是促进植物生长、细胞分裂和分化[2]。由于其在植物体内含量甚微，所以从少量样品中分离测定生长素具有重要的意义。 　　近年来，检测植物激素主要采用气相色谱质谱联用(GC和液相色谱质谱联用(LC技术。但是GC方法要求样品的衍生化以提高挥发性和灵敏度，样品处理过程复杂费时。LC技术虽然有较高的灵敏度和选择性，同位素内标物的使用使其定量更为准确[3～7]。但由于仪器和内标物的昂贵，限制了该方法的广泛应用。高效液相色谱(HPLC)是一种通用的分析仪器，其在植物激素测定研究中已有报道，但因生物体内激素的复杂性与特殊性，使其有效成分的提取分离成为极为关键的一步。HPLC法测定多种植物内源激素时经常发生分离差、峰型不良及严重拖尾现象[8]，且样品用量一般要求较多[9,10]，对一些特殊样品无法实现测试要求。因此，选择合适的植物激素提取方法和色谱条件尤为重要。 　　本研究建立的固相萃取高效液相色谱(HPLC)荧光检测法可以准确测定植物中的生长素类物质，样品用量少，可以满足普通分析实验室完成相关测试的要求。拟南芥(Arabidopsis thaliana)属被子植物，双子叶分纲，属十字花科。因其具有生命周期短、自花授粉、核基因组小，结构简单等优点，是植物细胞遗传学研究的经典模式材料[11]。建立拟南芥中植物激素生长素含量的测定方法对有关生长素作用机制及信号转导途径的研究具有重要意义。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配备Waters Empower化学工作站、Waters 2475荧光检测器、Waters sunfire C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、C18固相萃取小柱;旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); Himac CR 22G高速离心机(日本日立公司)。乙腈(色谱纯， Fisher公司);乙酸钠(分析纯， 北京化工厂);乙酸(分析纯， 国药集团化学试剂有限公司);吲哚乙酸(IAA)和吲哚丙酸(IPA)生长素标准品(Sigma公司);铜试剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠，纯度≥99.0%，Sigma公司);实验用水为ULTRA AN MK2超纯水仪(ELGA公司)制备的超纯水;拟南芥(中科院遗传与发育生物学研究所种植，生长期12 d，长日照，16 h光照，8 h黑暗。温度21～23 ℃，湿度50%～60%，光照强度80～120 μmol/(s·m2)。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 标准溶液的配制 根据拟南芥中生长素含量范围确定标样浓度[9]。准确称取0.05357 g吲哚乙酸和0.06458 g吲哚丙酸，用80%甲醇溶解并定容至25 mL，配制成2.14 g/L吲哚乙酸和2.58 g/L吲哚丙酸标准溶液。相应低浓度生长素标准液用80%甲醇稀释而成。 　　2.2.2 色谱条件 Waters sunfire C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相：乙腈10 mmol/L乙酸钠(20:80， V/V，乙酸调节至pH 3.5);流速1 mL/min ，进样量20 μL。柱温20 ℃;样品温度10 ℃;荧光激发和发射波长分别为275和345 nm。 　　2.2.3 样品处理 将实验用拟