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基于生物素亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究_临床医学论文 基于生物素亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究_临床医学论文 作者：穆晞惠 ,周志强 童朝阳 刘冰 郝兰群 【摘要】 利用生物素亲和素系统的放大作用和纳米金质量扩增效应，建立了压电免疫传感器检测相思子毒素的新方法。首先在石英晶体的金电极上依次组装二巯基丙酸、EDC和NHS进行表面修饰，然后通过亲和素固定生物素标记相思子毒素多抗来制备敏感膜，利用纳米金的质量扩增效应设计了一种“毒素纳米金标记单抗”复合物，成功实现了对相思子毒素的检测，提高了传感器灵敏度和重现性。本传感器对相思子毒素响应的线性范围为0.05～5 mg/L; 回归方程为Δf=50.81CAbrin+67.11(r=0.9903，n=10，0.0001); 检测灵敏度为50.81 Hz·L/mg。 【关键词】 压电免疫传感器， 生物素亲和素， 相思子毒素 1 引 言 　　相思子毒素(Abrin)是从豆科植物相思子种子中分离的一种细胞毒蛋白，毒性超过蓖麻毒素。其结构、作用机理与蓖麻毒素(Rcin)类似，中毒早期无特殊症状和病变，待发现症状后，已难以治疗[1～5]。因此，建立一种响应快速、灵敏的检测方法极为必要。曾有人采用放射免疫、酶联免疫检测等方法实现了对相思子毒素的检测，但检测过程繁琐、耗时。生物素亲和素系统(Botin是一种生物放大系统，具有灵敏度高、特异性强以及简便、经济、快速等特点。本研究利用BAS系统的放大作用和高稳定结合性、多克隆抗体的强富集力以及纳米金标记单克隆抗体的高度特异性、质量扩增效应与压电传感器芯片技术相结合，建立了一种可实时监控、操作简单、响应快速、灵敏度高的检测方法，为临床诊断、环境监测、食品卫生检验、法医学鉴定及生物反恐等应用领域提供技术基础和参考依据。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　压电免疫传感器装置(自制)。Abrin标准品、Abrin单抗和多抗、生物素标记Abrin多抗、金标Abrin单抗、纳米金溶胶均由本实验室制备;生物素化N羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)、聚乙二醇(PEG20000)、3,3′二巯基丙酸(DDPA)、N琥珀酰亚胺(NHS)、亲和素(Avidin)、1乙基二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)、乙醇胺均购自Sigma公司;Piranha液(V(H2SO4)∶V(H2O)=3∶1);实验用水为二次蒸馏水。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 多抗的生物素化标记、金标单抗制备及效价测定 参照文献[6，7] 制备生物素标记Abrin多抗和金标Abrin单抗，用间接ELISA法测定效价。 　　2.2.2 固定生物素标记Abrin多抗 加入100 μL 5 mmol/L DDPA于检测池中反应0.5 h;用水清洗后加入100 μL 100 mg/L EDC和100 μL 100 mg/L NHS，反应20 min;清洗后加入100 μL 100 mg/L亲和素反应1 h;清洗后加入100 μL 1 mol/L乙醇胺反应0.5 h;清洗后加入90 μL 0.01 mol/L Tris缓冲液(pH 7.9)，稳定后加入10 μL生物素标记Abrin多抗，至频率稳定。 　　2.2.3 Abrin金标Abrin单抗复合物的制备 将10 μL 250 mg/L金标Abrin单抗加到13.4 μL 70 mg/L Abrin溶液中(使Abrin终浓度为40 mg/L)，混匀，37 ℃反应0.5 h，4 ℃保存备用。 　　2.2.4 压电免疫传感器检测Abrin方法的建立 用二次蒸馏水清洗固定多抗后的电极，加入90 μL 0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4); 频率稳定后加入10 μL不同稀释度的Abrin金标Abrin单抗复合物，记录10 min的频移值，此过程如图1所示。 　　2.2.5 芯片再生 检测结束后，用热Piranha液浸泡金电极5 min，用水反复清洗，晾干后即可重复使用。 　　2.2.6 Abrin模拟样品的测定 取土壤、奶粉、饼干样品各1 g, 血液5 μL，加稀释液5 mL，搅匀;取自来水和鲜牛奶样品5 mL，加入13 μL 1000 mg/L Abrin，制成模拟样品。将以上样品以3000 r/min离心10 min，取上清液45.8 μL, 加入1 μL 250 mg/L金标单抗溶液(Abrin终浓度为2 mg/L)混匀，37 ℃反应0.5 h，计算检测回收率及相对标准差等指标。 　　3 结果与讨论 　　3.1 多抗与金标单抗的效价测定 　　制备的生物素标记Abrin多抗与金标Abrin单抗的效价分别约为1∶2.5×106和1∶6.3×105, 与标记前Abrin多抗、单抗效价基本相当，表明生物素、纳米金标记抗