基于磁珠处理的MALDITOF实验技术优化_临床医学论文.docVIP

基于磁珠处理的MALDI实验技术优化_临床医学论文 基于磁珠处理的MALDI实验技术优化_临床医学论文 【摘要】 目的：利用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（matrix，MALDI）技术检测血清中蛋白，目前常用磁珠来分离提纯，本研究目的是寻找一套有效的血清样品收集、处理、存储方法，应用于蛋白组学分析。方法：采用磁珠分离提纯人体血清，利用MALDI技术检测1 000～10 000 Da范围蛋白或多肽，考察其重复性及血清不同的冻融次数和基质与样品搭配比例对结果的影响。结果：人类血清的质谱图在1 000～10 000 Da范围内可检测到230多个峰，重复性极好。样品多次冻融对小分子量的多肽有一定影响。在适当范围内改变样品与基质比例对结果无影响。结论：基于磁珠分离提纯的MALDI技术在应用于人体血清检测时应用标准化程序可以减少变异。 【关键词】 蛋白质组学 磁珠疗法 基质辅助 激光解析离子化飞行时间质谱 【ABSTRACT】 Objective:Magnetic bead purification for the analysis of proteins in human blood serum facilitates the identification of potential new biomarkers with matrix（MALDIoteome fractionation technique and to validate a standardized blood sampling,processing,and storage procedure for proteomic pattern analysis.Methods:Magnetic bead separation was used for proteome profiling of human blood by MALDITOF MS（mass range,1 000～10 000 Da)and the effects on the reproducibility of the proteome analysis of the number of freezee of 1 000～10 000 Da.Serum mass patterns differed between samples in different freezedized preanalytical blood sampling and storage procedure in combination with magnetic beadbased fraction decreases variability of proteome patterns in human serum assessed by MALDITOF MS. 【KEY WORDS】 Proteomics,Magnetic Bead Therapy,MALDI 利用质谱进行蛋白质组学研究是近年兴起的、较为有效的研究方法，特别对于发现潜在的生物标志物，用以鉴别健康与疾病具有重大意义[1，2]。SELDI和MALDI技术在用于发现生物标志物方面国内外均有报道，他们与以往的双向电泳、多维液相色谱技术不同，灵敏度更高，而且工作量减少，节省时间。SELDI主要是将待测样品的多肽或蛋白片断浓缩于经过修饰的靶面，直接上质谱。其最早的临床报道是鉴别癌症，例如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和肺癌等，并且具有极高的灵敏度和特异度，引起轰动[3～9]，但重复性较差，同样的癌症利用相同的技术平台却得到不同的质谱图[10]，不同的实验室、相同实验室不同时间检测结果亦均不同，因此受到众多研究者的质疑。质疑主要集中在三个方面，第一，实验设计和数据的统计处理过程；第二，质谱技术本身的局限性；第三，所获得的数据的生物学意义[11]。 此次我们利用磁珠（其表面经预处理，抓取蛋白的表面积远大于SELSI的固体芯片，故又称液体芯片）进行血清蛋白提纯，观察质谱结果。 1 材料与方法 1.1 一般资料 随机选择男女各5人，血样品取自河北医科大学第四附属医院，患者清晨空腹，聚丙烯干燥管抽血5mL，室温静置1h，然后4 500转/min离心5min，取血清分装，-80°保存，分析时混合为一个样本。分离用成套试剂购自德国Bruker Daltonics公司，磁珠粒径小于1μm，选用Cu离子螯合磁珠进行分析。分析中所用的三氟乙酸、乙腈、乙醇、丙酮等均为色谱纯，购自BD公司。标准品为preptide和protein混合物，德国Bruker公司提供。 质谱仪用AutoflexШ型，产自德国Bruker公司，方法采用线性阳离子模式，参数设置如下：第一离子源2