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基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片的研制_临床医学论文 基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片的研制_临床医学论文 作者：胡宁　杨军　郑小林 阴正勤 徐海伟 张兴国　曹毅 杨静 夏斌 许蓉 鄢佳文 蒋凤 【摘要】 基于柔性印刷电路板(flexible printed circuits board, FPCB)技术，通过在聚酰亚胺基底薄膜表面层压的铜箔上刻蚀微电极阵列结构制备了一种细胞电融合芯片。在低电压(≤40 V)条件下实现了细胞电融合，融合效率达37%，远高于聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)法及传统细胞电融合方法。与传统细胞电融合系统相比，此芯片可在低电压条件下工作，具有结构简单、成本低廉、实验过程可观察、融合通量高等优点。另外，聚酰亚胺薄膜基底良好的柔软度可保证此芯片与其它分析模块(如细胞筛选分离模块)的有效集成，具备构造微全分析系统(micro total analytical system, μ的巨大潜力。 【关键词】 聚酰亚胺薄膜，电融合，芯片，微电极，柔性印刷电路板 　1 引 言 　　随着微机电系统(micro electromechanical system，MEMS)技术的快速发展和生命科学研究的现实要求，细胞电融合与生物芯片技术的结合逐渐深入，关于细胞电融合芯片的研究也越来越多[1～5]。目前，细胞电融合芯片融合通量普遍较低[6]，难以满足高效融合的要求。此外，细胞电融合微全分析系统(micro total analytical system, μ的概念也对芯片的集成和整体封装提出了更高要求[7]。 　　现有融合芯片主要用硅材料加工，但是由于硅片面积、工艺及成本的限制，不利于加工大规模的微电极阵列，从而限制了硅芯片技术的融合通量。此外，硅芯片的高硬度和不透明性也为芯片封装及实验观察带来了不利影响。本研究结合柔性印刷电路板(flexible printed circuits board, FPCB)技术，在面积较大的聚酰亚胺基底上加工了大量微电极组成的电极阵列，从而实现了一种柔性细胞电融合芯片，具备高通量融合的巨大潜力。 　　2 实验部分 　　2.1 材料 　　PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司);胰酶，DMEM高糖(海克隆生物化学制品有限公司);标准胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限公司);1.0%纤维素酶R酶溶液、0.5%离析酶R日本Yakult公司);10%甘露醇(北京鼎国生物技术公司)。CPW盐溶液： 27.2 mg KH2PO4, 101.0 mg KNO3, 1480.0 mg CaCl2·2H2O, 246.0 mg MgSO4·7H2O, 0.16 mg KI, 0.025 mg CuSO4·5H2O溶于1 L 三次蒸馏水中，调pH值至5.8;PM缓冲液：0.3 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L CaCl2, 1.2 mol/L山梨醇。其它试剂均为为分析纯。 　　HEK293细胞的制备：取生长良好的HEK293细胞，弃上清液。以3 mL PBS冲洗，弃上清液，反复进行3次。加入PBS和胰酶各2～3滴，消化1 min。加入3～5 mL培养液，其中V(DMEM高糖)∶V(标准胎牛血清)=10∶1，将贴壁细胞洗落、吹散，移至10 mL离心管中，离心(2000 r/min， 5 min)，弃上清液。加3 mL培养液将细胞吹散，分装。 　　烟草叶肉原生质体的制备：将烟草K326无菌苗幼嫩叶片切成细丝，取1.0 g置于13%甘露醇液体中，质壁分离(约3 h)后置于10 mL酶液中进行酶解。酶解过程在26.5 ℃黑暗条件下恒温振荡(50 r/min)12～16 h。酶解结束后，经不锈钢筛网过滤，滤液经500 r/min离心7 min。去除上清液，向所得沉淀中缓慢加入6 mL CPW21溶液(CPW盐溶入21%蔗糖)， 　　A. 芯片纵向结构(section structure of chip); B. 芯片水平结构(plane structure of chip).并使沉淀悬浮，以400 r/min离心6 min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10溶液(CPW盐溶入10%甘露醇)洗涤3次。 　　2.2 芯片制作 　　2.2.1 芯片加工 芯片加工过程：清洗聚酰亚胺薄膜，钻孔，沉积铜箔，层压，曝光，显影，蚀刻形成微电极阵列结构。镀金，在焊盘位置喷锡，外围裁减，等离子清洗，防氧化处理(芯片纵向结构见图1)。通过上述处理，获得了基于聚酰亚胺基底的细胞电融合芯片，面积为6 cm×5 cm，微电极阵列区面积为4 cm×3 cm，共有2.2×104个微电极。 　　2.2.2 芯片封装 制作一个不锈钢模具，超声清洗，烘干后用等离子清洗