蛋白质浓度测定.docVIP

考马斯亮蓝G 2 5 0 染色法 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律可在595nm处比色测定2-5分钟即呈最大光吸收至少稳定1小时该法操作简便迅速消耗样品量少但不同蛋白质之间差异大且标准曲线线性差高浓度的Tris EDTA 尿素甘油蔗糖丙酮硫酸铵和去污剂对测定有干扰缓冲液浓度过高时改变测定液pH值会影响显色考马斯亮蓝染色能力强比色杯不洗干净会影响光吸收值不可用石英杯测定 染色液取考马斯亮蓝G-250 100mg 溶于50mL 95% 乙醇中加100mL 85% 磷酸加水稀释至1升该染色液可保存数月若不加水可长期保存用前稀释。 取O.5mL未知浓度的蛋白溶液，用水补足到0.50mL 加0.3mL染色液立即摇匀 置室温20-25度放置15分钟然后于595nm波长处比色。 测定蛋白质浓度范围为0.01 mg/mL-1~ 1.0mg/mL-1 双缩脲法 具有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似也能与铜离子在碱性环境中形成紫红色复合物其最大光吸收在54Onm 其颜色深浅与蛋白质浓度成正比而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关该法测定范围为1 mg/mL-1 --10mg/mL-1双缩脲法常用于蛋白质的快速测定低浓度的铵盐不