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人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达_临床医学论文 人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达_临床医学论文 作者：冯宁翰　张炜　吴军　眭元庚　钱立新　华立新　贺伟峰　宋宁宏　吴宏飞 【关键词】 CTLA-4Ig 　　摘要：目的：运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体，为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法：采用基因技术，将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，利用PAdEasy系统进行重组，然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论：应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。 　　关键词：腺病毒;CTLA-4Ig;同源重组　 　　The Express and Recombinant of Adenovirus of Human CTLA-4Ig Gene 　　Abstract: Objective: To construct the recombinant adenovirus of human CTLA-4Ig gene .Method: The CTLA-4Ig gene was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination.Result: It is confirmed that the CTLA-4Ig gene were inserted successfully into the adenovirus by using restriction endonuclease and PCR analyses .Conclusion: The recombinant adenovirus of human CTLA-4Ig gene was successfully constructed. 　　Key words:Adenovirus；CTLA-4；Homogenic reconstruction 　　器官移植是治疗许多终末期疾病的唯一有效方法。但移植后的排斥反应是影响移植物功能与存活的最大的障碍。现代研究表明，T细胞的活化是引起急性排斥反应的最主要因素。CD28/ CTLA-4-B7是T细胞活化中重要的共刺激通道。阻断B7与CD28的结合，可以使移植物生存时间延长。CTLA-4存在于活化的T表面，是一种负调性的因子。它可以竞争性的阻断B7-CD28通路［1］。我们应用PAdEasy系统，构建了带荧光的CTLA-4Ig腺病毒载体，为研究B7-CD28在诱导免疫耐受中的作用奠定了良好的基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料：质粒和菌种：人CTLA4-Ig质粒由第三军医大学烧伤研究所保存，BJ5183菌株，Adeasier-1细胞，含绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的穿梭质粒pAdTrack-CMV,腺病毒基因组质粒PAdEasy-1购自美国Stratagene 公司。293细胞购自美国ATCC公司。 　　1.2 试剂：Hid iii,XbaI,限制性内切酶，T4 Ligase，TaqDNA聚合酶，DNA回收试剂盒购自Takara公司，质粒DNA提取盒购自Omiga公司， DMEM购自Hyclone公司，PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物由上海生物化学工程公司合成。 　　1.3 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-CTLA4-Ig的构建：腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig分别进行酶切提取DNA。用Hid iii单切pAdTrack-CMV后，再用XbaI酶切。Hid iii和XbaI酶双切pCTLA4-Ig质粒,通过0.8%的琼脂电泳，分别回收pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig的片段，两者的分子量分别为9.2Kb和1.4Kb。用T4 Ligase酶连接两者。钙转化大肠杆菌DH5α，挑选转化菌落，PCR筛选，提取质粒。酶切鉴定。 　　1.4 重组腺病毒质粒载体pAdEasy-1 -CTLA4-Ig的构建与鉴定。取25ｕl pAdTrack-CMV-CTLA4-I用PmeI 酶切线性化，然后去磷酸化，电转Adeasier-1细胞行同源重组（2500V，200Ohm,25ｕF）LB培养基37℃培养60min，涂于卡那抗性板，过夜。手工提取转化菌落，根据电泳的质粒分子量，初步筛选出阳性重组体，再根据PCR和酶切鉴定，提取阳性克隆。转至