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聚合酶链反应技术（PCR） 2009.8 PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 Mullis 1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（1个copy）。在模板DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100-200万copy. PCR技术的基本原理　其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的PCR反应体系： 　　　10×Buffer 　 ? 10ul　　　dNTP mixture 　 per 200umol/L　　　primers 　　　　 per 10～100pmol　　　　templete DNA 　　 0.1～2ug　　 　 DNA polymerase 　 2.5ul　　　　Mg2+　　　　　　 ? 1.5mmol/L　　　dH2O 　 ? 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 PCR 应用 遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症 传染性疾病 肝炎 性病 肿瘤 法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。 植物遗传育种 构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化 畜 牧 畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼 植物保护 杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分 实时定量PCR Real-time Quantity PCR 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。 作用原理 实时荧光定量PCR常用的检测模式： （1）TaqMan探针 （2）SYBR?GreenⅠ TaqMan探针方法的作用原理: 原理：利用Taq?酶的5‘→3’外切核酸酶活性并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。 TaqMan探针5‘端标以荧光发射基团，3’端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3‘端猝灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。 在PCR的退火期，探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5‘→3’外切核酸酶活性，继而发生置换，切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。