蛋白質分離 - 生物技術研發中心.docVIP

Introduction 最近數年間，蛋白質的分離、定量、定性之技術已大幅度的改良。而各項分離技術之間的結合、運用，使蛋白質能更有效的被分離，而參與後續的各項研究程序。由於蛋白質分子之間不同的特性(例如:分子大小、pI質)，而使其分離，同時也因該蛋白質特性的差異而發展出多維（multidimensional approach）2-D electrophoreis就是以蛋白質的電荷(第一維)與分子量大小(第二維)，已達分離的目的。然而各種分離技術均有優缺點，因此選擇適當的方法是分離的關鍵。 什麼是蛋白質體學呢？Yates定義為：紀述並且分析蛋白質、(protein interaction)、蛋白質之修飾(protein modification)的科學學科。簡單的來說，就是研究來至於細胞、組織或個體中的蛋白質，並以分子的層級來說明牽連蛋白質的個相細胞反應、過程。在下面的報告裡裡除了固有的蛋白體學上的各項技術之外，還有新穎的的分離(separation)、檢定(detection)與定量(quantification)將被討論於其中。蛋白質體(proteome)在研究上比基因體(genome)就困難，而不同形式的細胞具有不同的蛋白質體。 蛋白質體是動態的，因為它結合基因體、當下的環境、甚至該細胞的演化歷史。因此一細胞中的蛋白質體並不是單一且固定的。而且在人類的細胞中，約有20000蛋白質其是在特殊類型的細胞中才被表現出，又其表現出來的蛋白質濃度在不同時刻均不相同，因此更加深了蛋白質體在分析與研究上的複雜性。在2-D electrophoreis的分離技術中，蛋白質在膠體中的含量(約50-75％)不足以致難以檢測是該技術的缺點之一，因此樣本的製備(preparation)、濃度(concentration)、分離(separation)及檢測(detection)等方式均需要重新研發，以解決2-D electrophoreis的缺點。 目前在做expression proteomic兩大主流： Gel base： 缺點：2D要做的好，一定要sample preparation做的好，只要sample preparation沒做好，要會看不到正確的訊息，而且2D不容易看到membrane protein，再來就是一定要用人工，無法自動化。 優點：是到目前唯一可以同時分析超過兩千點protein的方法，而且可以看到isoform 以及 post translation modification。由於2D有著MDLC無法取代的優點，因此到現在在蛋白質體學研究仍然廣泛的應用，也因此Sample preparation的工作也就特別重要。 LC base： 缺點：MDLC在做時，是將蛋白質都切成peptide，因此會容易lost掉一些訊息 優點：好處是靈敏度較高，而且可以自動化 ※2-D gel electrophoresis 分離大量蛋白質時，我們通常採用2-D gel electrophoresis(研究蛋白質體學的必要技術)，但在最近的研究中發現2-D PAGE和MS一同作用時，只能偵測出量大的蛋白質，，， ※Multidemensional HPLC,CE and HPLC-CE protein/peptide separations 分離細胞或組織中的所有蛋白質並不是一件簡單的事情，人類細胞中有數以千計的蛋白質，經代謝後更會產生大量的peptides，要用單一的chromatographic或electrophoretic技術來分離這樣大的一個複合物是不可能的事情，所以我們必須採用多維的方法;在2-D gel electrophoresis中，蛋白質是先被分離，再被trypsin切，最後peptide fragments才被MS分析出來。但在chromatographic和capillary electrophoresis的多維方法中，蛋白質是先經切過才被分離，這麼做的好處是peptide和parent proteins比起來溶解度較高也較易分離，尤其是對厭水的mem-brane proteins而言，壞處呢？就是我們必須解決數量更大的peptides。HPLC-CE可以on-line或off-line,讓我們分離此大量的peptides，並簡化之後的MS分析。 研究蛋白質的主要流程及注意事項： 由於不可能將一個生物所有的蛋白質全部分離出，再全部一起去分析，這樣會無從下手，照成不必要的浪費，因此在實驗之前要先想清楚實驗目的為何，再根據所要做的實驗、要分析什麼樣的蛋白質，去決定如何做樣本前處理，處理完後再決定要用哪種方法去分離出所要的蛋白質。找出哪個方法對自己的實驗才是最好的方法。 流程： 拿到一個樣品，該如何做蛋