组织工程动脉血管平滑肌种子细胞构建.pdfVIP

组织工程动脉血管平滑肌 种子细胞的构建* 刘庆阳 汪忠镐 谷涌泉 张 建 罗 涛 郭连瑞 吴英峰 （首都医科大学宣武医院血管外科研究所） 宋业光 （中日友好医院整形外科 北京 100053 ） 摘要：目的：为组织工程动脉提供种子细胞。方法：采用组织贴块法培养成年狗主动脉平滑肌细胞， 并进行细胞传代、鉴定及形态学观察。结果：通过严格取材即可获得高纯度培养的平滑肌细胞，其形 态学特征明显，但随培养代次的增加，其增殖能力及形态出现改变。结论：成年狗主动脉平滑肌细胞 可作为动脉组织工程的种子细胞，其增殖能力有待于进一步加强。 关键词：组织工程动脉 细胞培养 平滑肌细胞 0 前言 随着各种直径大小的血管移植物在心血管外科、周围血管手术中的应用, 血管移植物 (Vasculargraft) 的研究成为人们关注的热点。临床已应用的血管移植物包括生物血管,人工血管 (Bloodvesselprosthesis)和复合血管(Biosyntheticvasculargraft) 。但无论那一种都有自身的缺陷，阻碍 了其在临床上的应用。尤其是在小口径 （＜6 mm ）动脉的替代物上，目前临床上主要用自体大隐 静脉、头静脉或桡动脉等，然而这些自身血管都有其自身的缺陷，而且来源也有限，从而妨碍了 血管重建的发展。近年来,细胞工程技术和组织培养技术的发展,使得人们有可能在体外重建有功能 的组织。组织工程学应运而生,运用组织工程学原理来构建人工血管就成为新的热点。 动脉的平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMC)是构建组织工程化动脉的主要步骤之一。因此， 获得增殖良好的平滑肌细胞，建立稳定的平滑肌细胞培养体系，是进行动脉组织工程的基础和必 备条件。SMC 原代培养操作繁琐,影响因素较多,成功率往往不高,尤其是成年狗动脉平滑肌细胞的 培养难度较大。本文参照国内外有关文献[1~3],尝试多种方法及摸索经验，成功培养出高质量的狗 的主动脉平滑肌细胞，建立了狗主动脉平滑肌细胞的培养方法，并使这一培养技术更趋完善,有效 地为进一步进行组织工程化动脉血管的培养奠定基础。现将此方法介绍如下。 1 材料与方法 (1) 主要仪器设备及试剂：倒置显微镜(OLYM-PUS,JAPAN),MCO 175 型 CO2 培养箱 (SANYO,JAPAN),超净工作台(月坛集团),低温冰箱(SANYO),塑料培养瓶、培养板(COSTAR 公司), 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS.北京元亨圣马生物技术研究所),DMEM 培养液(GIBCO 公 司,USA),胰蛋白酶(SIGMA 公司),I 型胶原酶(GIB-CO 公司), α-肌动蛋白抗体(中山公司),SABC 显 色试剂盒(SIGMA 公司,中山公司分装) 。 *国家863 计划课题基金资助项目（2001AA216071 ） (2)试验动物：成年狗体重20～30 kg 。 (3)细胞培养 ①原代培养：在动物手术间无菌条件下取出狗的主动脉胸腹段,用D-hanks 液冲洗，并置于4 ℃ D-hanks 液中迅速送至细胞培养室，在超净台中用双抗液浸泡，然后D-hanks 液洗涤凝血,剥除 外膜纤维脂肪层,纵行剖开血管, 内膜面向上,固定,刮去内膜,然后撕下中膜。试验中发现主动脉的中 膜可非常容易地撕下两层，将两层撕下的中膜分别用D-hanks 漂洗3 次后剪成碎块。 采用贴块法培养：组织块剪成 1 mm3 或更小,放入培养液中(含 20% 胎牛血清,0.03% L 谷氨酰 胺,100 U/ml 青霉素,100 μg/ml 链霉素) 。用吸管将小组织块均匀地种植于25 ml 培养瓶内。接种 后翻转培养瓶,补加培养液至所需体积,倒置放于 37 ℃恒温培养箱内,4-6 ｈ后将培养瓶水平放置, 使组织块浸没于培养液中,静置培养6～10 ｄ。然后每3-4 天换液，换液时可逐渐将组织块冲洗掉。 ②细胞传代：当原代培养的细胞达到相对融合状态时即可传代 （时间为15-20 天）。有时细胞 爬出不均匀时,可原瓶消化培养，传代时