节杆菌产脂肪酶地研究.pdfVIP

节杆菌产脂肪酶的研究 唐芸宋庆训魏东芝 (华东理工大学生物反应器国家重点实验室，鲁华生物技术研究所) 脂肪酶(Lipase，Ec3．1．1．3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛地存在于动物组织、植物 种子和微生物体中，它能催化天然底物油脂(甘油三脂)水解，产生脂肪酸和甘油。在水解 过程中存在中间产物甘油单酯和甘油二酯。从催化特性来看，脂肪酶可以催化脂类化合物的 分解、合成和酯交换，具有化学选择性和高度的立体异构专一性，且反应不需要辅酶，反应 条件温和，副产物少。脂肪酶的另一显著特点是：它只能在异相系统(即油一水界面)或有 机相中作用，这不仅发展了“界面酶学”，也促进了“非水酶学”的研究和深八。 脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应。这些反应通常具有高 度的底物专一性、区域选择性或对映选择性，使脂肪酶成为有机合成中重要的生物催化剂， 广泛应用于油脂、食品、香料、化妆品、医药、农药等有机合成领域中。微生物脂肪酸多数 来源于真菌和细菌，大量的脂肪酶已商业化生产。最新公布的34种不同来源的商业化脂肪 酶中有18种来源于真菌，7种来源于细菌。 本实验室研究的J一13就是从土壤中筛选出来的一株天然细菌，它是一种严格好氧菌。 菌种筛选 0 0．2％；K2HP040．1％；KCl5％：MgS04‘7H200．05％； 1．筛选培养基配方：(NH4)2S04 FeS04·7H200001％； 琼脂2％；pH自然。取橄榄油与3％聚乙烯醇溶液l：3比例混合，高 速匀浆机搅拌乳化5分钟，单独灭菌。灭菌后取25ml加入200ml上述培养基中，即为筛选 培养基。 2．土样是取白上海浦东某油厂的附近。将50．49土样加200ml无菌水稀释，吸取0．5ml加 入45ml无菌水记为lO。样，吸取O．5ml10“样加入4．5ml无菌水记为10。样，再吸取0．5m110。 加入4．5ml无菌水记为10。样。每个样品平行做六次。分别将每个10‘1样、10。样、10、3样 吸取0．1ml在平板上涂布。放置于28C培养箱中培养。在平板上生长的菌是可以利用油脂 的，其产生脂肪酶的可能性很大。培养一周后挑取平板上生长且在菌落周围有透明圈的菌落 在筛选培养基上划线进行纯种培养。 3．菌株J一13的水解斑大且明显，分别将其接种到含有和不含有橄榄油的摇瓶中进行培养 测定酶活。结果表明，含有橄榄油的发酵液测得有酶活，而不含有橄榄油的发酵液没有酶活， 说明J一13菌产脂肪酶是需要诱导的。 4经鉴定，该菌为十二节杆菌，国内外未见该种菌脂肪酶的报道，有报道同属菌脂肪酶能 够手性拆分多种药物中间体。 优化培养基条件 对J一13做培养条件优化实验，进行摇瓶培养优化，然后在5升发酵罐上放大。摇瓶优 化的结果是每ml发酵液酶活从最初的20多提高到40左右，发酵罐放大后，最高酶活可达 75。 1 摇瓶培养条件优化过程：进行单因子条件优化，分别对碳源、氮源、无机盐和温度等影 响因素进行实验，确定葡萄糖、橄榄油和大豆色拉油作复合碳源，大豆蛋白胨和牛肉膏作为 复合有机氮源。 5％：MgS04’74120 ’最终确定下来的种子培养基：葡萄糖1％；橄榄油1％；大豆蛋白胨1 0．63％。 O 05％：K2HP041．8％：Nall2P04 191 而摇瓶培养基为：葡萄糖O6％：橄榄油1％；大豆色拉油1％；牛肉膏1％；大豆蛋 0．05％：COCl2 I．8％； 白胨l％：MgS04·71t20 0．0img／lOOml：K2HP04 。 NaH2P040 63％ 2．发酵罐条件优化过程：以摇瓶培养基为基础放大进行5升罐上发酵