辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因克隆和转基因烟草耐盐性研究.pdfVIP

辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及 转基因烟草耐盐性研究 李秋莉“。刘大伟1高晓蓉1包永明1安利佳1 (1大连理工太事，大连116012，2辽宁师范大学，大连116029) 摘要甜菜碱是生物休内普遍存在的一种报有效的渗透调节荆。高等植轴中，甜菜碱由胆碱蛙 两步酶催氧化得到，即。胆碱—+甜菜碱醛一甜幕碱，催化第一步反应的碑是胆碱单加氧酶 (choline aidehyde cDNA全序列1901个核苷酸．其中包括5’端非编码区66个核苷醢，3’端非编 liaotutlgensis)BADH 码区329个轼苷酸，合有2个可能的加polyA信号：AAT从，开放阅读框1506个核苷酸，编码一 eDNA全序列已纳入GenBank数据库，注册 个由502个氨基酸构成的多胜。本文报道的SIBADH tabacum 烟革(Nicti删4 89)，获得潮霉素抗性植抹，PCR和杂交均证明BADH基画巳整合到蛔革 基因组中，转基因烟革中BADH酶活性明显高干对照蛔革，甜菜碱的含量也有一定程度的提高，且 具有一定的耐盐性，能在含1．2“NaCl的培养基中正常生长。 关键调辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因克隆转基因烟草耐盐性 在盐害、干旱、低温等渗透胁迫下，许多生物体内会积累与细胞代谢相容的无毒的渗透调 节物质，如甘油、甘露醇、脯氨酸、蔗糖、海藻糖和甜菜碱等。在研究过的多种渗透调节剂中，甜 菜碱是一种广泛分布的非常有效的渗调剂，在细菌、藻类、动物和多种植物中普遍存在着调节 渗透压，保护代谢中重要酶类活性的作用。高等植物中，甜菜碱是以胆碱为底物经两步酶催氧 化生成，即；胆碱一甜菜碱醛一甜菜碱，催化第一步反应的是胆碱单加氧酶(choline )，催化第二步反应的是甜菜碱醛脱氢酶(betaine monooxygenase，CMO，E．C．1．1—1 aldehyde 其合成酶基因的研究成为抗逆基因工程研究的重点。现已从菠菜、甜菜、山菠菜、高粱、大麦、红 树等多种植物中克隆了BADH基因，获得了耐盐的转基因烟草、水稻、小麦、玉米等。本研究 以盐生植物辽宁碱蓬(Suaeda eDNA的同源序列设计引物，通过RT—PCR和 据已发表的菠菜、甜菜和山菠菜的BADH RACE法获得了辽宁碱蓬BADHeDNA全序列，构建了植物表达载体，并进行了转化烟草的 研究。 1材料和方法 1．1材料 植物材料辽宁碱蓬(Suaeda 161 余试剂为国产分析纯。 1．2方法 1．2．1RNA的提取 每天定时用海水(约舍3％NaCI)浇灌处理辽宁碱蓬，7d后取新鲜叶片，液氮研磨后， TRIZOL试剂盒提取总RNA。 1．2．2BADH cDNA全序列的获得 1．2．2．1BADH eDNA部分序列的获得 。以提取的总RNA为模板，根据已发表的菠菜、甜菜和山菠菜的BADHeDNA的同源序列 CAC一，使用反转录试剂盒进行RT—PcR，回收扩增片段进行测序。 1．2．2．zBADHeDNA51端序列的获得 根据上述测序结果，在靠近5’端处设计一条5’末端磷酸化的反转录引物B3：一(p) B5；一CcAGAAGTAGCAGCCCAATC一；B6 I 增片段进行测序。 1．2．2．3BADHeDNA 31端序列的获得 AAGCCCTT一3’，利用反转录试剂盒中Oligo M13Primer M4一步PCR扩增出BADH的3’端片段，回收扩增片段进行测序。 1．2．2．4序列拼接 进行序列校正，最后获得拼接好的序列。 1．2．2．5全长序列鉴定 全长eDNA片段，回收扩增片段进行测序。