PCR实验技术总结.docVIP

增加PCR的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~60% c. 5端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC (有人说：3 端最好是 GC/CG/CC/GG。)e. 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3端的错配g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al. * primer的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PC